本發(fā)明公開一種檢測口含煙制品對細(xì)胞超氧化物歧化酶影響的方法，包括以下步驟：(1)受試物的前處理；(2)人口腔角質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的制備；(3)人口腔角質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度的計算；(4)人口腔角質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞接種；(5)受試物的分組；(6)受試物檢測劑量的設(shè)定；(7)受試物培養(yǎng)品的制備；(8)受試物的孵育；(9)受試物孵育品的收集；(10)樣品制備；(11)樣品測定；(12)蛋白濃度測定；(13)超氧化物歧化酶酶活力的計算。本發(fā)明對樣品的有效處理、檢測劑量的優(yōu)化設(shè)定以及靶細(xì)胞的正確選擇，使得本方法能夠準(zhǔn)確有效的檢測口含煙制品對細(xì)胞超氧化物岐化酶酶活力影響的方法。

1.一種檢測口含煙制品對細(xì)胞超氧化物歧化酶影響的方法，其特征在于，包括以下具體步驟：(1)受試物的前處理：準(zhǔn)確稱取1.0g口含煙制品，加入30mL無血清培養(yǎng)基，于37℃下靜置24h，萃取，萃取后先用定性濾紙進(jìn)行初濾除渣處理，再用0.45μm有機濾膜過濾除菌，得到待測液；(2)人口腔角質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的制備：人口腔角質(zhì)細(xì)胞復(fù)蘇后，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5vt％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的匯合和形態(tài)情況，待細(xì)胞長至90％的匯合率時，移除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質(zhì)量：體積；單層孵育約1-2min，用OKM細(xì)胞培養(yǎng)基懸起，形成單細(xì)胞懸浮液；(3)人口腔角質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度的計算：用血球計數(shù)板計數(shù)法對步驟(2)得到人口腔角質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度進(jìn)行計算，計算出每毫升人口腔角質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的活細(xì)胞數(shù)；(4)人口腔角質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞接種：將步驟(3)計數(shù)后的人口腔角質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液加入OKM細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至2.0×10⁵個/mL，接種到直徑為60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿4mL，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5vt％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細(xì)胞對照組和檢測樣品組；各組的構(gòu)成為：細(xì)胞對照組為OKM細(xì)胞生長培養(yǎng)基上種植人口腔角質(zhì)細(xì)胞；檢測樣品組為在OKM細(xì)胞生長培養(yǎng)基上種植人口腔角質(zhì)細(xì)胞并添加受試物；(6)受試物檢測劑量的設(shè)定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：12.5％樣品萃取液、25％樣品萃取液、50％樣品萃取液、75％樣品萃取液、100％樣品萃取液；(7)受試物培養(yǎng)品的制備：移除步驟(4)中直徑為60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的OKM細(xì)胞培養(yǎng)基，再按步驟(5)進(jìn)行分組，各組的構(gòu)成為：細(xì)胞對照組為OKM細(xì)胞培養(yǎng)基+人口腔角質(zhì)細(xì)胞；檢測樣品組為OKM細(xì)胞培養(yǎng)基+人口腔角質(zhì)細(xì)胞+受試物，并使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設(shè)定的劑量；用OKM細(xì)胞培養(yǎng)基將每孔液體體積補足至4mL；(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣后的直徑為60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37℃、5vt％CO₂培養(yǎng)箱中孵育24h；(9)受試物孵育品的收集：去除步驟(8)中的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗一遍，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質(zhì)量：體積；單層孵育約1-2min，用OKM細(xì)胞培養(yǎng)液懸起，1000rpm低溫離心10min；(10)樣品制備：收集(9)步驟得到的細(xì)胞，加入100μL細(xì)胞裂解液，細(xì)胞裂解需在冰浴下進(jìn)行，裂解后收集細(xì)胞，1600rpm低溫離心10min，取上清液待后續(xù)測定；(11)樣品測定：在不同離心管內(nèi)加入20μL樣品待測液，空白對照1加入20μL檢測緩沖液，空白對照2加入40μL檢測緩沖液；檢測樣品組和空白對照組分別加入180μL氮藍(lán)四唑顯色工作液，37℃下孵育30分鐘，于560nm測定吸光度；(12)蛋白濃度測定：測定樣品蛋白濃度；(13)超氧化物歧化酶酶活力計算：a.抑制百分率的計算：根據(jù)(11)測定的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值計算抑制百分率，抑制百分率＝(A空白對照1－A樣品)/(A空白對照1－A空白對照2)×100％b.SOD酶活力的計算：待測樣品中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)unitsSOD酶酶活性(U/mg)＝待測樣品中SOD酶活力單位/樣品蛋白量(mg)。