本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組表達(dá)、分離純化人源Fn3蛋白突變體作為N?糖基化效率檢測(cè)模式蛋白的應(yīng)用方法。該方法包括以下步驟：Fn3突變體Fn3?Gly?loop重組蛋白基因表達(dá)載體構(gòu)建、將構(gòu)建的表達(dá)載體用電擊法共同轉(zhuǎn)化到大腸桿菌工程菌株CLM37，經(jīng)抗生素篩選得到陽(yáng)性克隆，此重組蛋白就含有將被重組糖基修飾的Fn3?Gly?loop蛋白、Western Blot法檢測(cè)Fn3?Gly?loop融合蛋白糖基化效率。本發(fā)明在大腸桿菌體內(nèi)用骨架蛋白Fn3作為受體蛋白，建立適合進(jìn)行N?糖基化修飾效率研究的模式受體蛋白，可以解決在大腸桿菌體內(nèi)簡(jiǎn)單、快速、高效地檢測(cè)重組蛋白糖基化效率的問題。

1.一種利用骨架蛋白Fn3在大腸桿菌體內(nèi)建立N-糖基化效率檢測(cè)受體蛋白模型的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)、Fn3突變體Fn3-Gly-loop重組蛋白基因表達(dá)載體構(gòu)建：1)根據(jù)Fn3骨架蛋白晶體結(jié)構(gòu)，用PyMOL軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)模建設(shè)計(jì)糖基化位置，分別在Fn3蛋白loop區(qū)通過編碼柔鏈GGGGS引入編碼糖基化位點(diǎn)序列DQNAT，再通過編碼柔鏈GGGGS引入編碼6個(gè)組氨酸殘基堿基序列，糖基化突變位點(diǎn)即GGGGSDQNATGGGGSHHHHHH；2)根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，合成Fn3-Gly-loop基因，并克隆到pIG6H質(zhì)周腔表達(dá)載體上，形成攜帶Fn3-Gly-loop基因的表達(dá)載體，命名為pIG6H-Fn3-Gly-loop；3)將pIG6H-Fn3-Gly-loop與攜帶來源空腸彎曲菌的N-糖基化基因簇載體的pACYCpgl載體，在大腸桿菌質(zhì)周腔內(nèi)共同表達(dá)，該載體攜帶的基因簇用于合成寡糖，其寡糖分子組成為GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-(Glc–β1,3-)GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-GalNAc-α1,3-Bac-β1；(2)、將步驟2)中構(gòu)建的載體及pACYCpgl用電擊法共同轉(zhuǎn)化到大腸桿菌工程菌株CLM37，經(jīng)抗生素篩選得到陽(yáng)性克隆，此陽(yáng)性克隆表達(dá)的重組蛋白就含有將被重組糖基修飾的Fn3-Gly-loop蛋白，具體步驟為：將陽(yáng)性克隆接種到含有100微克每毫升的氨芐青霉和37微克每毫升的氯霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，每升LB固體培養(yǎng)基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化鈉10克和15克瓊脂粉，過夜24小時(shí)培養(yǎng)，篩選出單克隆后將其接種到含有100微克每毫升的氨芐青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，過夜16小時(shí)培養(yǎng)；以1:100接種到10毫升含有100微克每毫升的氨芐青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，200rpm、37℃培養(yǎng)，直至OD₆₀₀達(dá)到0.6；以1:100接種到100毫升含有100微克每毫升的氨芐青霉素和37微克每毫升的氯霉素的自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25-35℃、200rpm條件誘導(dǎo)表達(dá)24小時(shí)，在此過程，在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白Fn3-Gly，自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基中含有以下重量的各組分：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氫二鈉7.1克，磷酸二氫鉀6.8克，硫酸銨3.3克，硫酸鈉0.9克，七水硫酸鎂0.25g；(3)、收集菌體裂解后Western Blot法檢測(cè)Fn3-Gly-loop融合蛋白糖基化效率。