本發(fā)明公開了一種具有穿膜功能的hMnSOD-R9及其制備方法與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)與生物化學(xué)領(lǐng)域。通過(guò)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到引入R9的MnSOD的hMnSOD-R9基因片段，將該片段連接到pET15b構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET15b-hMnSOD-R9，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主Rosetta-gami得到表達(dá)菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9。對(duì)該菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)得到高效可溶的hMnSOD-R9，破碎表達(dá)菌體后直接對(duì)上清進(jìn)行純化，極大的簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，降低了成本，解決了SOD工業(yè)化生產(chǎn)SOD原料的限制問(wèn)題。

1.一種用于制備具有穿膜功能的hMnSOD-R9的質(zhì)粒pET15b-hMnSOD-R9，
其特征在于：所述的質(zhì)粒pET15b-hMnSOD-R9由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列
與pET15b質(zhì)粒構(gòu)建而成。
2.一種用于制備具有穿膜功能的hMnSOD-R9的菌株
Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9，其特征在于：所述的菌株
Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9通過(guò)將權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒
pET15b-hMnSOD-R9轉(zhuǎn)化Rosetta-gami得到。
3.一種具有穿膜功能的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于包括如下步
驟：
(1)權(quán)利要求2所述的菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9作為表達(dá)菌
株，基于大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；
(2)收集菌體，用裂解液重懸重懸菌體，冰浴中超聲破碎至溶液澄清，收
集上清，用Ni-NTA樹脂純化得到hMnSOD-R9。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于：
步驟(1)中所述的誘導(dǎo)表達(dá)為：挑取Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9單
菌落接種于5mL含200mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基于37℃、220rpm培養(yǎng)過(guò)
夜；按1:100的比例取2mL培養(yǎng)過(guò)夜菌液接種到200mL含200mg/mLAMP的
LB培養(yǎng)基37℃、220rpm培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為0.5時(shí)，加入終濃度為0.5mM的IPTG，
于30℃、220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)5h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于：
步驟(2)中所述的收集菌體的條件為4℃、5000rpm離心15min收集；收
集上清的條件為4℃、13000rpm離心15min收集；
步驟(2)中所述的裂解液為：50mMNaH₂PO₄，pH8.0，300mMNaCl，10
mM咪唑；Ni-NTA樹脂純化所用洗滌緩沖液為：50mMNaH₂PO₄，pH8.0，300mM
NaCI，20mM咪唑，洗脫緩沖液為：50mMNaH₂PO₄，pH8.0，300mMNaCI，
250mM咪唑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于：所述的具
有穿膜功能的hMnSOD-R9的制備方法還包括將步驟(2)得到的hMnSOD-R9
用PBS透析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于：所述的透
析條件為：用10mMpH7.4的PBS作為透析液，把目的蛋白裝入透析袋里透析，
室溫下每8h更換一次PBS，更換3次。