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一種從Cohn組分Ⅳ沉淀中純化α1-抗胰蛋白酶的方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-12-01
  • 技術成熟度:正在研發
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201611021105.0 
  • 技術(專利)名稱 一種從Cohn組分Ⅳ沉淀中純化α1-抗胰蛋白酶的方法 
  • 項目單位 中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所
  • 發明人 章金剛,張晉超,趙雄,呂茂民,馬玉媛,皇甫超濟,賈俊婷 
  • 行業類別 健康產品質檢-質量檢驗
  • 技術成熟度 正在研發
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 陳瑾
  • 發布時間 2021-12-01  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了一種從Cohn組分Ⅳ沉淀中純化α1?抗胰蛋白酶的方法,將Cohn組分Ⅳ沉淀依次經過Cohn組分Ⅳ沉淀溶解濃縮、PEG沉淀、一次病毒滅活、一次超濾濃縮、三次層析精制、凍干、二次病毒滅活,最終得到α1?抗胰蛋白酶。本發明的方法以低溫乙醇法生產白蛋白的廢棄物——Cohn組分Ⅳ沉淀為起始原料制備AAT,有利于提高原料血漿的綜合利用率。整個方法過程中采用PEG沉淀結合陰離子交換層析、兩次藍色染料親和層析,可有效去除雜質蛋白,最終獲得純度大于95%的AAT制劑,比活大于3900U/mg。
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  • 02

    說明書

    1.一種從Cohn組分Ⅳ沉淀中純化α1-抗胰蛋白酶的方法,其特征在于,將Cohn組分Ⅳ沉淀依次經過溶解濃縮、PEG沉淀、一次病毒滅活、一次超濾濃縮、三次層析精制、凍干、二次病毒滅活,最終得到α1-抗胰蛋白酶(AAT);所述三次層析精制為一次陰離子交換層析精制和兩次藍色染料親和層析精制;用所述陰離子交換層析精制中洗脫AAT的AAT洗脫液平衡藍色染料親和層析精制中的藍色染料親和層析柱,及用來洗脫AAT;所述AAT洗脫液為含45-65mM NaCl的pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸鹽緩沖液;所述二次病毒滅活是將凍干所得AAT凍干品在99-100℃的水浴中進行干熱法病毒滅活處理30min;所述藍色染料親和層析精制中首先用所述AAT洗脫液平衡藍色染料親和層析柱,然后上樣,之后用所述AAT洗脫液沖洗藍色染料親和層析柱以去除未與藍色染料結合的AAT,得到AAT穿透樣品,整個純化過程的流速為70-120cm/h;藍色染料親和層析柱的介質選自親和配基為藍色染料的親和層析介質BlueSepharose 6Fast Flow;兩次所述藍色染料親和層析精制中二次藍色染料親和層析與一次藍色染料親和層析的柱體積比為1:(15-20)。2.根據權利要求1所述方法,其特征在于,用陰離子交換層析精制中平衡陰離子交換層析柱的平衡液洗脫去除未結合在柱上的轉鐵蛋白和白蛋白。3.根據權利要求2所述方法,其特征在于,所述平衡液為pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸鹽緩沖液。4.根據權利要求2所述方法,其特征在于,所述陰離子交換層析精制中首先用平衡液平衡陰離子交換層析柱,然后上樣,之后先用同一平衡液沖洗陰離子交換層析柱以去除未結合在柱上的轉鐵蛋白和白蛋白,再用pH4.6-4.8、10-50mM醋酸鹽緩沖液洗脫結合在柱上的白蛋白和維生素D結合蛋白,最后用AAT洗脫液洗脫AAT,得到AAT洗脫樣品,整個純化過程的流速為150-350cm/h。5.根據權利要求4所述方法,其特征在于,陰離子交換層析柱的介質選自離子交換基團為二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl,DEAE)的弱陰離子交換層析介質或離子交換基團為季胺基(quaternary ammonium group)的強陰離子交換層析介質。6.根據權利要求1-5任一所述方法,其特征在于,兩次藍色染料親和層析精制使用同一藍色染料親和層析柱;具體為:一次藍色染料親和層析結束后,用過的藍色染料親和層析柱用含0.5-1.0M KSCN的pH 5.0-8.5、10-50mM醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗脫結合在柱上的分子量>180kDad的大分子雜蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白、維生素D結合蛋白。7.根據權利要求6所述方法,其特征在于,所述一次病毒滅活中將PEG沉淀所得上清液的pH值調節至6.5-7.5,0.22μm濾膜過濾,加入磷酸三正丁酯和吐溫-80使其終濃度按g/100mL,分別為0.3%、1%,23-25℃恒溫水浴6h進行S/D法病毒滅活處理,得到滅活上清液。8.根據權利要求7所述方法,其特征在于,所述二次病毒滅活中將凍干所得AAT凍干品在99-100℃的水浴中進行干熱法病毒滅活處理30min以滅活囊膜病毒和非囊膜病毒,得到最終的α1-抗胰蛋白酶。9.根據權利要求8所述方法,其特征在于,具體包括以下步驟:a)、Cohn組分Ⅳ沉淀溶解、濃縮:Cohn組分Ⅳ沉淀用8-10倍重量的水溶解,0-10℃攪拌2-4h,調節pH值至7.5-8.0,固液分離,棄固體,得到Cohn組分Ⅳ溶解液,將Cohn組分Ⅳ溶解液超濾濃縮4-10倍體積得到Cohn組分Ⅳ濃縮液,Cohn組分Ⅳ濃縮液中的蛋白含量為20-40mg/ml;b)、PEG沉淀:調節步驟a)所得Cohn組分Ⅳ濃縮液的pH值至5.0-5.4,0-10℃加入PEG4000至其終濃度按g/100mL,為10-15%,攪拌使PEG 4000完全溶解,0-10℃靜置后4000-6000g下離心20-60min,棄去包含分子量>180kDa的大分子雜蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白和維生素D結合蛋白的沉淀,取上清液;c)、一次病毒滅活:將步驟b)所得上清液的pH值調節至6.5-7.5,0.22μm濾膜過濾,加入磷酸三正丁酯(tri-n-butyl phosphate,TNBP)和吐溫-80(Tween 80)使其終濃度按g/100mL,分別為0.3%、1%,23-25℃恒溫水浴6h進行S/D法病毒滅活處理,得到滅活上清液;d)、一次超濾濃縮:用pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸鹽緩沖液超濾步驟c)所得滅活上清液,得到超濾液,超濾膜的截留分子量為20-30kDa;e)、陰離子交換層析精制:采用陰離子交換層析純化步驟d)所得超濾液;陰離子交換層析介質選用離子交換基團為二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl,DEAE)的弱陰離子交換層析介質或離子交換基團為季胺基(quaternary ammonium group)的強陰離子交換層析介質;首先用pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸鹽緩沖液作為平衡液平衡陰離子交換層析柱,然后將步驟d)所得超濾液上樣,之后先用同一平衡液沖洗未結合在柱上的轉鐵蛋白和白蛋白,再用pH4.6-4.8、10-50mM醋酸鹽緩沖液洗脫結合在柱上的白蛋白和維生素D結合蛋白,最后用含45-65mM NaCl的平衡液作為AAT洗脫液洗脫AAT,得到AAT洗脫樣品,整個純化過程的流速為150-350cm/h;f)、一次藍色染料親和層析精制:采用藍色染料親和層析純化步驟e)所得AAT洗脫樣品;藍色染料親和層析介質選用親和配基為藍色染料的親和層析介質;首先用AAT洗脫液平衡藍色染料親和層析柱,然后將步驟e)所得AAT洗脫樣品上樣,之后用AAT洗脫液沖洗未與藍色染料結合的AAT,得到一次AAT穿透樣品,整個純化過程的流速為70-120cm/h;用過的藍色染料親和層析柱用含0.5-1.0M KSCN的pH 5.0-8.5、10-50mM醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗脫結合在柱上分子量>180kDa的大分子雜蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白、維生素D結合蛋白,然后重復利用;g)、二次藍色染料親和層析精制:首先用AAT洗脫液平衡藍色染料親和層析柱,藍色染料親和層析介質同步驟f);然后將步驟f)所得一次AAT穿透樣品上樣,之后用AAT洗脫液沖洗未與藍色染料結合的AAT,得到二次AAT穿透樣品;步驟g)與步驟f)中藍色染料親和層析柱的柱體積比為1:(15-20);h)、凍干:超濾濃縮步驟g)所得二次AAT穿透樣品,使該樣品的蛋白含量達到10-20mg/ml,然后加入保護劑組氨酸,組氨酸終濃度為0.05-0.1M,0.22μm濾膜過濾除菌,分裝,凍干,得到AAT凍干品;i)、二次病毒滅活:將步驟h)所得AAT凍干品在99-100℃的水浴中進行干熱法病毒滅活處理30min,得到最終的α1-抗胰蛋白酶(AAT)。
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專利技術附圖

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