本發明公開一種用于鑒別診斷馬屬動物是否感染梨形蟲病的檢測試劑盒及其制備與使用方法。本發明的檢測馬梨形蟲試劑盒內有檢測馬梨形蟲的檢測膜和梨形蟲通用引物。本發明的試劑盒的使用方法是從待檢馬匹血液中提取DNA，再用梨形蟲通用引物進行擴增，將擴增產物與檢測膜結合，將PCR產物末端的生物素與鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase)作用后，能催化過氧化物酶的底物增強化學發光試劑(ECL-detection)發出熒光，使X感光膠片曝光；膠片經顯影和定影處理后，與檢測膜上探針與PCR產物發生特異性雜交的相對應的區域出現陰影，根據膠片上有無留下陰影來判斷被檢動物是否有患有梨形蟲病。

1.用于檢測馬梨形蟲的試劑盒，其特征是試劑盒內有檢測馬梨形蟲的檢測膜和梨形蟲通用引物，其中：?檢測馬梨形蟲的檢測膜是在Biodyne?C膜的不同區域分別固定有如下述的五種核苷酸序列的探針：?梨形蟲通用探針C-all：CTGTCAGAGGTGAAATTCT；?巴貝斯蟲通用探針B-all：CCTTRGTAATGGTTAATAGGAA；?駑巴貝斯蟲特異探針B-cab：AAACCCTCGCCAGAGTAACAATT；?泰勒蟲通用探針T-all：WVCCRRAGTAATGGTTAATAGG；?馬勒蟲特異探針T-equi：TTTTAGGAGCCRGAGTAATGGTTA；?以上序列中的R、W或V是兼并堿基，其中：R＝A或G；W＝A或T；V＝A或C或G；?梨形蟲通用引物為：?上游引物RLB-F：5’-gaggtagtgacaagaaataacaata-3’；?下游引物RLB-R：biotin-5’-tcttcgatcccctaactttc-3’。?2.權利要求1所述的用于檢測馬梨形蟲的試劑盒中的檢測膜制備方法，其特征是人工合成如下五種核苷酸序列：?梨形蟲通用探針C-all：CTGTCAGAGGTGAAATTCT；?巴貝斯蟲通用探針B-all：CCTTRGTAATGGTTAATAGGAA；?駑巴貝斯蟲特異探針B-cab：AAACCCTCGCCAGAGTAACAATT；?泰勒蟲通用探針T-all：WVCCRRAGTAATGGTTAATAGG；?馬勒蟲特異探針T-equi：TTTTAGGAGCCRGAGTAATGGTTA，?將各序列的5′端用氨基團進行修飾后待用，?1)將各核酸探針按下述用量稀釋于150μL的pH?8.4的500mM?NaHCO3中待用：?梨形蟲通用探針C-all5～50pmol；巴貝斯蟲通用探針B-all12～100pmol；駑巴貝斯蟲特異探針B-cab50～100pmol；泰勒蟲通用探針T-all?50～100pmol；馬勒蟲特異探針T-equi?10～100pmol；?2)將Biodyne?C膜剪成預定的尺寸并標記方向和順序后，用去離子水配制10mL新鮮的16％(w/v)的EDAC溶液，將前述Biodyne?C膜放在盛有16％的EDAC溶液的容器內，在室溫下不斷地旋轉容器，進行孵育、活化處理；將活化的Biodyne?C膜用去離子水漂洗2后放入潔凈的印跡儀內并除去印跡儀孔槽中殘留的液體；?3)將150μL稀釋好的各探針溶液分別加入印跡儀的目標孔槽中，其中第一個和最后一個孔不加探針，用2×SSPE將墨水稀釋后加入第一個孔和最后一個孔，未加探針的多余孔槽用2×SSPE緩沖液填充，再在室溫條件下孵育2分鐘后除去各個孔槽內的液體，所用的2×SSPE緩沖液為pH7.4，用0.2M?Na₂HPO₄、3.0M?NaCl和20mM?EDTA配制而成；將經前處理的膜用新鮮配制250mL的100mM?NaOH溶液孵育膜10分鐘，使Biodyne?C膜鈍化后再用去離子水漂洗；?4)用250mL的2×SSPE/0.1％SDS緩沖液在60℃溫度條件下漂洗經前處理的膜，再用100mL?20mM?pH?8.0的EDTA溶液在室溫條件下，漂洗膜，再將該Biodyne?C膜在4℃條件下密封保存直至使用。?