本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別涉及核酸的檢測(cè)技術(shù)，具體為microRNA的測(cè)序方法，根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)待測(cè)microRNA的特異性的擴(kuò)增引物和待測(cè)microRNA的焦磷酸測(cè)序引物，所述擴(kuò)增引物的其中一條引物被生物素標(biāo)記；提取待測(cè)樣本的DNA，用設(shè)計(jì)的所述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得擴(kuò)增引物，其中，所述特異性擴(kuò)增引物中的任一條用生物素標(biāo)記；將所得PCR擴(kuò)增物采用堿變性分開(kāi)成單鏈，取其中生物素標(biāo)記單鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，與所述測(cè)序引物進(jìn)行雜交反應(yīng)，并分析結(jié)果;本發(fā)明所選取的microRNA靶序列，以及應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)microRNA基因型，能夠滿(mǎn)足臨床檢驗(yàn)實(shí)際工作的需要，利于microRNA基因檢測(cè)預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生、發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)。

1.microRNA的測(cè)序方法，所述測(cè)序方法為非疾病診斷和治療目的的方法，其特征在于，
所述測(cè)序方法為焦磷酸測(cè)序法，結(jié)合二重PCR擴(kuò)增技術(shù)，具體包括以下步驟：
A特異性引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)待測(cè)microRNA的特異性的擴(kuò)增引物和待測(cè)microRNA的焦磷酸測(cè)序引
物，所述擴(kuò)增引物的其中一條引物被生物素標(biāo)記；在步驟A中，所述測(cè)序引物具體為：has-
miR-146ars2910164的測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:17所示:has-miR-
149rs2293832的測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:18所示；has-miR-196a-2rs11614913
的測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示；has-miR-492rs2289030的測(cè)序引物的核苷
酸序列如SEQIDNO:20所示；has-miR-544brs10934682的測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQ
IDNO:21所示；has-miR-604rs2368392的測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:22所示；
has-miR-605rs2043556的測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:23所示；has-miR-
608rs4919510的測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:24所示；
BPCR反應(yīng)
提取待測(cè)樣本的DNA，用步驟A涉及的所述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得擴(kuò)增物，其中，
所述擴(kuò)增引物中的一條用生物素標(biāo)記；
C焦磷酸測(cè)序
將步驟B所得PCR擴(kuò)增物采用堿變性分開(kāi)成單鏈，取其中生物素標(biāo)記單鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
純化后，與步驟A所述測(cè)序引物進(jìn)行雜交反應(yīng)，并分析結(jié)果；
在步驟A中，所述擴(kuò)增引物具體為：has-miR-146ars2910164位點(diǎn)的特異性引物：其上
游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示；has-miR-149rs2293832位點(diǎn)的
特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:3所示，下游引物如SEQIDNO:4所示；has-miR-
196a-2rs11614913位點(diǎn)的特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:5所示，下游引物如SEQID
NO:6所示；has-miR-492rs2289030位點(diǎn)的特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:7所示，下
游引物如SEQIDNO:8所示；has-miR-544brs10934682位點(diǎn)的特異性引物：其上游引物如
SEQIDNO:9所示，下游引物如SEQIDNO:10所示；has-miR-604rs2368392位點(diǎn)的特異性引
物：其上游引物如SEQIDNO:11所示，下游引物如SEQIDNO:12所示；has-miR-
605rs2043556位點(diǎn)的特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:13所示，下游引物如SEQID
NO:14所示；has-miR-608rs4919510位點(diǎn)的特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:15所示，
下游引物如SEQIDNO:16所示；
所述靶位點(diǎn)包括has-miR-146ars2910164、has-miR-149rs2293832、has-miR-196a-
2rs11614913、has-miR-492rs2289030、has-miR-544brs10934682、has-miR-
604rs2368392、has-miR-605rs2043556和has-miR-608rs4919510位點(diǎn)；
在步驟B中，has-miR-146ars2910164和has-miR-608rs4919510進(jìn)行二重PCR，和/或
has-miR-149rs2293832和has-miR-605rs2043556進(jìn)行二重PCR，和/或has-miR-196a-
2rs11614913和has-miR-604rs2368392進(jìn)行二重PCR，和/或has-miR-492rs2289030和has-
miR-544brs10934682進(jìn)行二重PCR。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的microRNA的測(cè)序方法，其特征在于：在步驟B中，has-miR-146a
rs2910164和has-miR-608rs4919510進(jìn)行二重PCR的退火溫度為62℃；has-miR-
149rs2293832和has-miR-605rs2043556進(jìn)行二重PCR的退火溫度為55℃；has-miR-196a-
2rs11614913和has-miR-604rs2368392進(jìn)行二重PCR的退火溫度為52℃；has-miR-
492rs2289030和has-miR-544brs10934682進(jìn)行二重PCR的退火溫度為58℃。