本發(fā)明涉及一種涉及47種基因的PCR引物以及標(biāo)簽PCR引物，所述標(biāo)簽PCR引物由PCR引物以及連接于PCR引物對(duì)中至少一條引物5’端的DNA標(biāo)簽序列組成，所述DNA標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO:107—SEQ ID NO:126。本發(fā)明還涉及應(yīng)用所述由標(biāo)簽PCR引物的DNA標(biāo)簽構(gòu)建測(cè)序文庫的方法和試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100％，所提供的擴(kuò)增引物與DNA標(biāo)簽形成一個(gè)特異性、靈敏度和重復(fù)性之間達(dá)到優(yōu)化、平衡的檢測(cè)產(chǎn)品，能并行檢測(cè)體細(xì)胞突變與單核苷酸多態(tài)性，一次檢測(cè)能夠準(zhǔn)確區(qū)分1?20種樣本來源的多條堿基序列。

1.一種PCR引物，其特征是，包含所有如下針對(duì)目標(biāo)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物序列：針
對(duì)AKT1基因的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，針對(duì)AKT3基因的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，
針對(duì)APC基因的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，針對(duì)ATM基因的
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，針對(duì)BRAF基因的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:
13和SEQ ID NO:14，針對(duì)CDH1基因的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，針對(duì)CDKN2A基因的SEQ
ID NO:17和SEQ ID NO:18，針對(duì)CTNNB1基因的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，針對(duì)CYP2D6
基因的SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24，針對(duì)CYP3A5基因的
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，針對(duì)DPYD基因的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28，針對(duì)EGFR
基因的SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，針對(duì)ERCC1基因的SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32，針
對(duì)ERCC2基因的SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34，針對(duì)FGFR1基因的SEQ ID NO:35和SEQ ID
NO:36，針對(duì)FGFR2基因的SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，針對(duì)FGFR3基因的SEQ ID NO:39和
SEQ ID NO:40，針對(duì)FLT3基因的SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42，針對(duì)GSTP1基因的SEQ ID
NO:43和SEQ ID NO:44，針對(duì)HER2基因的SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46，針對(duì)HRAS基因的
SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48，針對(duì)IDH1基因的SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，針對(duì)IDH2
基因的SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52，針對(duì)KIT基因的SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，針對(duì)
KRAS基因的SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58，針對(duì)MEK1基因
的SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60，針對(duì)MET基因的SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62，針對(duì)
MTHFR基因的SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66，針對(duì)NRAS基因
的SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68，針對(duì)PDGFRA基因的SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70，針對(duì)
PIK3CA基因的SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72，針對(duì)PIK3R1基因的SEQ ID NO:73和SEQ ID
NO:74，針對(duì)PIK3R5基因的SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76，針對(duì)PTEN基因的SEQ ID NO:77和
SEQ ID NO:78，針對(duì)PTPN11基因的SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80，針對(duì)RB1基因的SEQ ID
NO:81和SEQ ID NO:82，針對(duì)STK11基因的SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:85和
SEQ ID NO:86，針對(duì)TP53基因的SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88，針對(duì)TPMT基因的SEQ ID
NO:89和SEQ ID NO:90，針對(duì)TSC1基因的SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92，針對(duì)TYMS基因的
SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94，針對(duì)UGT1A1基因的SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96，針對(duì)
VEGFA基因的SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98，針對(duì)VEGFR2基因的SEQ ID NO:99和SEQ ID
NO:100，針對(duì)VEGFR3基因的SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102，針對(duì)VHL基因的SEQ ID NO:
103和SEQ ID NO:104，針對(duì)XRCC1基因的SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106。
2.一種標(biāo)簽PCR引物，其特征是，由權(quán)利要求1所述的PCR引物以及連接于每對(duì)引物中至
少一條的5’端的DNA標(biāo)簽序列組成，所述DNA標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO:107—SEQ ID NO:
126。
3.一種DNA標(biāo)簽構(gòu)建測(cè)序文庫的方法，其特征是，主要包括以下步驟：
A.分別提取至少一個(gè)待檢測(cè)樣本中的DNA；
B.采用針對(duì)目標(biāo)基因突變位點(diǎn)的權(quán)利要求2所述的標(biāo)簽PCR引物，PCR擴(kuò)增不同的待測(cè)
樣品，針對(duì)不同的待測(cè)樣品的標(biāo)簽PCR引物中的DNA標(biāo)簽序列不同；
C.純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將不同待測(cè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物混合，構(gòu)成核酸測(cè)序文庫。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA標(biāo)簽構(gòu)建測(cè)序文庫的方法，其特征是，待檢測(cè)樣本的數(shù)量
為1-20個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA標(biāo)簽構(gòu)建測(cè)序文庫的方法，其特征是，待檢測(cè)樣本的數(shù)量
為20個(gè)。
6.一種高通量測(cè)序的方法，其特征是，主要包括以下步驟：
A、采用權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)的DNA標(biāo)簽構(gòu)建測(cè)序文庫的方法，建立核酸測(cè)序文庫；
B、將核酸測(cè)序文庫依次進(jìn)行末端修復(fù)、連接接頭以及純化回收連接產(chǎn)物；
C、對(duì)上述連接產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以確定所述核酸測(cè)序文庫的序列信息。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高通量測(cè)序的方法，其特征是，所述步驟B中接頭的堿基序列
如SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示。
8.一種DNA標(biāo)簽構(gòu)建測(cè)序文庫的試劑盒，其特征是，包含有：針對(duì)不同樣品的不同PCR引
物組，所述每組PCR引物組中包含有53對(duì)PCR引物對(duì)，且每對(duì)PCR引物對(duì)中至少一條的5’端連
接有DNA標(biāo)簽序列，所述同一引物組的DNA標(biāo)簽序列相同，不同引物組的DNA標(biāo)簽序列不同，
所述DNA標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO:107—SEQ ID NO:126，所述PCR引物對(duì)如權(quán)利要求1所述。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA標(biāo)簽構(gòu)建測(cè)序文庫的試劑盒，其特征是，包括有針對(duì)不同
樣品的20組PCR引物組，該20組標(biāo)簽PCR引物中的DNA標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO:107—SEQ ID
NO:126，且每組中的DNA標(biāo)簽序列各不相同，每組標(biāo)簽PCR引物中的PCR引物序列為：針對(duì)
AKT1基因的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，針對(duì)AKT3基因的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，針
對(duì)APC基因的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，針對(duì)ATM基因的SEQ
ID NO:9和SEQ ID NO:10，針對(duì)BRAF基因的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和
SEQ ID NO:14，針對(duì)CDH1基因的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，針對(duì)CDKN2A基因的SEQ ID
NO:17和SEQ ID NO:18，針對(duì)CTNNB1基因的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，針對(duì)CYP2D6基因
的SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24，針對(duì)CYP3A5基因的SEQ
ID NO:25和SEQ ID NO:26，針對(duì)DPYD基因的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28，針對(duì)EGFR基因
的SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，針對(duì)ERCC1基因的SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32，針對(duì)
ERCC2基因的SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34，針對(duì)FGFR1基因的SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:
36，針對(duì)FGFR2基因的SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，針對(duì)FGFR3基因的SEQ ID NO:39和SEQ
ID NO:40，針對(duì)FLT3基因的SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42，針對(duì)GSTP1基因的SEQ ID NO:43
和SEQ ID NO:44，針對(duì)HER2基因的SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46，針對(duì)HRAS基因的SEQ ID
NO:47和SEQ ID NO:48，針對(duì)IDH1基因的SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，針對(duì)IDH2基因的
SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52，針對(duì)KIT基因的SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，針對(duì)KRAS基
因的SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58，針對(duì)MEK1基因的SEQ
ID NO:59和SEQ ID NO:60，針對(duì)MET基因的SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62，針對(duì)MTHFR基因
的SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66，針對(duì)NRAS基因的SEQ ID
NO:67和SEQ ID NO:68，針對(duì)PDGFRA基因的SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70，針對(duì)PIK3CA基因
的SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72，針對(duì)PIK3R1基因的SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74，針對(duì)
PIK3R5基因的SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76，針對(duì)PTEN基因的SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:
78，針對(duì)PTPN11基因的SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80，針對(duì)RB1基因的SEQ ID NO:81和SEQ
ID NO:82，針對(duì)STK11基因的SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:
86，針對(duì)TP53基因的SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88，針對(duì)TPMT基因的SEQ ID NO:89和SEQ
ID NO:90，針對(duì)TSC1基因的SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92，針對(duì)TYMS基因的SEQ ID NO:93
和SEQ ID NO:94，針對(duì)UGT1A1基因的SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96，針對(duì)VEGFA基因的SEQ
ID NO:97和SEQ ID NO:98，針對(duì)VEGFR2基因的SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100，針對(duì)VEGFR3
基因的SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102，針對(duì)VHL基因的SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104，
和針對(duì)XRCC1基因的SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106。