一種重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法，屬于酶制劑、發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵過(guò)程控制組合優(yōu)化，得出適合重組枯草芽孢桿菌培養(yǎng)方法；將重組枯草芽孢桿菌接入種子培養(yǎng)基后，搖床培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種一定量的種子液到調(diào)整后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每3h取樣測(cè)定酶活力等參數(shù)。本發(fā)明采用組合優(yōu)化的策略對(duì)重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，將發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件組合起來(lái)優(yōu)化，使得重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的能力得到了大幅度的提高，亮氨酸氨肽酶的酶活力達(dá)到605 U/mL。

1.一種重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于發(fā)酵罐發(fā)酵工藝具體步驟為：（1）種子液的制備：將-40℃甘油管保存的重組枯草芽孢桿菌菌種Bacillus subtilis WB600接入到種子培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，控制搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)10h，得到種子液；所述種子培養(yǎng)基為氯化鈉10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L；重組枯草芽孢桿菌，含連接了來(lái)源于枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶基因全序列的PMA5質(zhì)粒，宿主菌Bacillus subtilis WB600；（2）發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液以5％的量接種到7L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的裝液量為4L，通入無(wú)菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速250-450rpm，通氣比為1.2︰1，溶氧與攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，維持最低溶氧在30％，發(fā)酵培養(yǎng)30h；發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程的前12h的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37℃，12h后發(fā)酵培養(yǎng)溫度調(diào)整為30℃；發(fā)酵培養(yǎng)到15h時(shí)，一次性補(bǔ)加500g/L的葡萄糖補(bǔ)料液，使得發(fā)酵液中還原糖濃度為5g/L；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉20 g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸氫二鉀6 g/L，氯化鈷0.6 mmol/L、用去離子水配制；產(chǎn)酶促進(jìn)劑為：氯化鉀0.1 mol/L、谷氨酸鈉0.6％、酒石酸鉀0.7％、吐溫-80 2.4 mL/L；（3）參數(shù)測(cè)定：發(fā)酵過(guò)程中，每隔3h取樣，測(cè)定亮氨酸氨肽酶酶活力、生物量。