1.一種臍帶間充質干細胞分化為神經細胞的誘導方法,其特征是采用以下步驟:
(1)將臍帶間充質干細胞在MSC培養基中培養至鋪滿培養皿;
(2)取穩定傳代的間充質干細胞在鋪有胞外基質的培養皿中以MSC培養基培養至
70%匯合;
(3)70%匯合的間充質干細胞依次經過添加有如下因子的四種誘導培養基培養,
第一種誘導培養基:添加5-氮胞苷和三酰疊氮脂蛋白,
第二種誘導培養基:添加堿性成纖維細胞生長因子和Noggin蛋白,
第三種誘導培養基:添加堿性成纖維細胞生長因子、維甲酸、成纖維細胞生長
因子8和Wnt3a蛋白,
第四種誘導培養基:添加骨成形蛋白4、Shh蛋白、維甲酸、神經生長因子和
腦源性神經營養因子;
四種誘導培養基中添加因子的量分別為:
第一種:5-氮胞苷1-50uM和三酰疊氮脂蛋白0.1-1ug/ml,
第二種:堿性成纖維細胞生長因子1-200ng/ml和Noggin?1-500ng/ml,
第三種:堿性成纖維細胞生長因子1-200ng/ml、維甲酸0.5-50uM、成纖維
細胞生長因子81-100ng/ml和Wnt3a蛋白1-500ng/ml,
第四種:骨成形蛋白4?1-200ng/ml、Shh蛋白1-500ng/ml、維甲酸0.5-50uM、
神經生長因子1-500ng/ml和腦源性神經營養因子1-500ng/ml。
2.根據權利要求1所述的誘導方法,其特征在于:四種誘導培養基中添加因子的量
優選為
第一種:5-氮胞苷10uM和三酰疊氮脂蛋白0.5ug/ml,
第二種:堿性成纖維細胞生長因子25ng/ml和Noggin?100ng/ml,
第三種:堿性成纖維細胞生長因子25ng/ml、維甲酸10uM、成纖維細胞生
長因子810ng/ml和Wnt3a?25ng/ml,
第四種:骨成形蛋白420ng/ml、Shh蛋白10ng/ml、維甲酸10uM、神經生
長因子10ng/ml和腦源性神經營養因子10ng/ml。
3.根據權利要求1所述的誘導方法,其特征在于:四種誘導培養基的基礎培養基為
添加有B27輔劑的Neurobasal或者添加有BIT9500的DMEM/F12。
4.根據權利要求1所述的誘導方法,其特征在于:MSC培養基組成為DMEM中添
加胎牛血清10%、谷氨酰胺2mM、青霉素和鏈霉素1%、堿性成纖維細胞生長因
子和表皮生長因子2ng/ml。
5.根據權利要求1所述的誘導方法,其特征在于:所述胞外基質為1-100ug/ml層粘
連蛋白或者1-100ug/ml基質膠的水溶液。
6.根據權利要求1所述的誘導方法,其特征在于:在四種誘導培養基中各培養3天。
7.根據權利要求1所述的誘導方法,其特征在于:取穩定傳代的間充質干細胞在鋪
有胞外基質的培養皿中以5×103個細胞/cm2的密度培養。
8.根據權利要求1所述的誘導方法,其特征在于:步驟(2)中取穩定傳代的間充質
干細胞在鋪有胞外基質的培養皿中以MSC培養基培養24-48h。
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