本發明提供了一種基于磁性分離和量子點標記的檢測人A群鏈球菌抗原的方法，該方法包括（1）制備抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠；（2）制備量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針；（3）將待檢樣品用PBST緩沖液溶解后，向溶解液中加入抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠，充分混合及反應后進行磁分離，以PBST緩沖液洗滌，向得到的沉淀物中加入量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針，反應后磁分離，以PBST緩沖液洗滌后，使用熒光酶標儀檢測熒光值。本發明具有準確、快速、高靈敏度的檢測人A群鏈球菌的方法，其在人M1，3，5，6，24血清型A群鏈球菌的臨床診斷、病原學鑒別、流行病學調查等方面具有很高的實用價值。

1.一種用于制備基于磁性分離和量子點標記的檢測人A群鏈球菌抗原的試劑盒的方
法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：
1)抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠的制備：
1.1)兔及鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG的制備
1.1.1)重組M-His融合蛋白的制備、純化：
1.1.1.1)對人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白進行生物信息學分析，分別獲取其N端型
特異性序列中含胞外抗原表位且不與其他抗原抗體起交叉反應的的肽段；
1.1.1.2)找到步驟1.1.1.1)中所得到五個肽段一一對應的基因編碼序列，按M1-M3-
M5-M6-M24的順序進行序列拼接并根據大腸桿菌中密碼子的偏好性對該序列進行密碼子優
化，在上述經密碼子優化后的重組基因的序列的5’端及3’端引入酶切位點并化學合成全基
因序列，同時標記記為m；
1.1.1.3)將步驟1.1.1.2)中所得到的m按分子生物學方法克隆入表達載體pET-28a(+)
后轉入大腸桿菌中表達重組M-His融合蛋白；所述重組M-His融合蛋白以可溶性表達方式存
在于菌體中；
1.1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.1.3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測其純度后，以
Bradford法測定蛋白質濃度，調整蛋白濃度為0.2mg/mL后備用；
1.1.2)兔及鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG的制備：
1.1.2.1)以步驟1.1.1.4)中所得到的重組M-His融合蛋白為完全抗原，分別免疫新西
蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清及鼠抗人A群鏈球
菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清；所述兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清及鼠抗人A
群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清的間接ELISA效價均大于1×10⁵；所述間接ELISA是重
組M-His融合蛋白作為包被抗原為基礎；
1.1.2.2)采用Protein G親和層析柱分別純化兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗
血清及鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG；
1.1.2.3)用凱基Bradford蛋白含量檢測試劑盒測定步驟1.1.2.2)所得到的多克隆抗
體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調整為1mg/mL后備用；
1.2)免疫納米磁珠的包被：
1.2.1)取5mg磁珠，用1ml MES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進行磁分離后移
除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe₃O₄為內核、粒徑為350nm的羧基磁珠；所述MES緩沖液是質
量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES緩沖液的pH＝6.0；所述納米磁分離器的磁
性強度是0.4T；
1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC溶液以及
用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以10-
40rpm于旋轉混合儀中活化1hr，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，用1ml步驟
1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
1.2.3)取5個離心管，在每個離心管中加入200μL步驟1.2.2)所得到的活化后的磁珠，
置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度
為50-300μg/ml的由步驟1.1)所制備的兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體
IgG溶液各1ml，室溫下以15rpm于旋轉混合儀中反應2-6h，置于納米磁分離器中進行磁分離
后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以15rpm于旋轉混合儀
中反應2h以封閉磁珠上未與抗體反應的羧基；所述PBS緩沖液中各成分含量如下：8g/L
NaCl，0.2g/L KCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄，所述PBS緩沖液的pH＝7.4；
1.2.4)封閉反應完成后，將該5個離心管置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，
各用1ml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/L NaCl，0.2g/L
KCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄，0.5ml/L Tween-20，所述洗滌緩沖液的pH＝7.4；
1.2.5)向各個離心管中分別加入1ml保存緩沖液重懸磁珠，置于4℃保存備用；所述保
存緩沖液中各成分含量如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄，
0.3g/L NaN₃，5g/L牛血清白蛋白，所述保存緩沖液的pH＝7.4；
2)量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針的制備：
其具體制備方法包括：
2.1)向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點、600nmol N-羥基硫代琥珀酰
亞胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，混合溶液，37℃反應
30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及EDC，得到活化后的量子點；所述磷酸
鹽緩沖液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述
磷酸鹽緩沖液的pH＝7.4；
2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入4-16nmol的步驟1.1)中所制備的鼠抗
人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG，避光反應2h，加入單端氨基化聚乙二醇
PEG2000-NH₂至終濃度為1％，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應1h；
2.3)用0.2μm PES濾器過濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉移到50000MW
超濾離心管中，以8000g離心力在4℃下離心15min，除去未發生偶聯反應的抗體和反應中的
副產物；
2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗
滌液中，再將此溶液轉移到一個新的50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4℃下離心
15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于1ml磷酸鹽保存液中，置于4
℃保存備用；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫
鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH＝7.4；所述磷酸鹽
保存液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛
血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH＝7.4；
3)PBST緩沖液的配制：
其具體配制方法包括：
取8g NaCl，0.2g KCl，0.24KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄，0.3g NaN₃，0.5ml Tween-20溶解于
800ml蒸餾水中，用5M NaOH調整pH至7.4，再定容至1000ml；
4)質控品的制備：
4.1)陽性質控品：陽性質控品由滅活的人M1型A群鏈球菌干燥結合到拭子上而成；
4.2)陰性質控品：陰性質控品即經臨床確定為人A群鏈球菌陰性的人群的咽拭子；所述
人A群鏈球菌是人A群鏈球菌M1，3，5，6，24血清型。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1.2.2)中，依次加入用步驟
1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液
配制的濃度是10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以15rpm于旋轉混合儀中活化1hr，置于納
米磁分離器中進行磁分離后移除上清，用1ml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后
的磁珠；
所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為240μg/ml的由步驟
1.1)所制備的兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG溶液各1ml，室溫下以
15rpm于旋轉混合儀中反應3h，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清后，各加入1ml
含1mg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液；
所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入12nmol的步驟1.1)中所
制備的鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG，避光反應2h。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述量子點是羧基化兩親聚合物修飾
的水溶性CdSe/ZnS量子點。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述磁珠是以超順磁性Fe₃O₄為內核、殼材
料為聚苯乙烯、表面官能團為羧基、粒徑為350nm的羧基磁珠。