本發(fā)明提供了一種基于雙酶擴(kuò)增系統(tǒng)的核酸檢測方法。該核酸檢測方法反應(yīng)系統(tǒng)中包含了DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸探針，一段短引物，DNA聚合酶和過氧化合酶。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸探針首先固定在96孔板。加入目標(biāo)核酸后，該核酸與包被的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸的環(huán)部分完全互補(bǔ)配對，從而打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在引物和聚合酶作用下，通過引物合成新鏈能把目標(biāo)核酸置換下來，最終生成大量帶有生物素標(biāo)記雙鏈核酸產(chǎn)物，與親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶結(jié)合。最后催化底物四甲基聯(lián)苯氨顯色，通過酶標(biāo)儀定量檢測，該方法最低能檢測到8aM的核酸。本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測方法通過兩次信號擴(kuò)增，從而達(dá)到高靈敏度檢測的目的。本發(fā)明為核酸檢測提供高通量和高靈敏度的檢測手段。

1.一種基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測方法的試劑盒，其特征在于，包括以下成分：3%?γ-球蛋白溶液；直徑5?nm的金納米顆粒溶液，其中氯金酸濃度為0.01%；發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針，其結(jié)構(gòu)為5’-SH-TCTTGGACAC-檢測目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列-GTGTCCAAGA-生物素-3’，即所述探針全長40個堿基，兩端的各10個堿基組成互補(bǔ)的莖狀結(jié)構(gòu)，中間的互補(bǔ)序列是根據(jù)檢測目標(biāo)序列而設(shè)計(jì)的20個堿基；短引物，該短引物的序列為TCTTGGAC，與所述探針的3’端互補(bǔ)；50?mM?Tris-HCL，pH8.0；聚合酶；dNTPs；6%?DMSO；0.1%?BSA；MgCl₂溶液；親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶；TMB-H₂O₂，作為辣根過氧化物酶的底物反應(yīng)液；陽性對照核酸；0.01?M?PBS，作為洗滌液以及陰性對照；以及2mol/L?H₂SO₄，作為反應(yīng)終止液。2.?一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雙酶擴(kuò)增的試劑盒的非疾病診斷目的核酸檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：A）在微孔板上包被3%?γ-球蛋白溶液50?μL，4℃過夜；再用250?μL、0.01?M的PBS洗滌3次。B）加入直徑5?nm的金納米顆粒溶液50?μL，其中氯金酸濃度為0.01%，4℃反應(yīng)12小時；再用250?μL、0.01?M的PBS洗滌3次；C）加入0.5?μM的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針50?μL，4℃過夜；用250?μL、0.01?M的PBS洗滌3次；加入250?μL、50?mM的巰基乙醇4℃封閉12小時，250?μL、0.01?M的PBS洗滌3次；?D）加入第一次信號擴(kuò)增體系緩沖液，37℃反應(yīng)30分鐘，進(jìn)行第一次信號擴(kuò)增；所述的第一次信號擴(kuò)增體系緩沖液包含：50?μL、50?mM?Tris-HCL，pH8.0；50nM?短引物，該短引物與所述探針的3’端互補(bǔ)；3單位聚合酶；50?μM?dNTPs；6%?DMSO；0.1%?BSA；5?mM?MgCl₂；以及不同濃度的檢測目標(biāo)序列核酸；反應(yīng)后用250?μL、0.01?M的PBS洗滌3次；E）加入50?μL、1?μg/mL?的親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，20-25℃反應(yīng)5分鐘，進(jìn)行第二次信號擴(kuò)增；反應(yīng)后用250?μL、0.01?M的PBS洗滌3次；F）加入50μL?(TMB)-H₂O₂溶液20-25℃反應(yīng)5分鐘；酶標(biāo)儀450nm波長檢測。