本發(fā)明公開了一種同步定量測定蔬菜中總?cè)~酸及其衍生物含量的方法，依次包括以下步驟：1）、提取蔬菜中葉酸；2）、在步驟1）所得的蔬菜葉酸提取物中加入老鼠血清軛合酶孵育，離心后，得蔬菜葉酸去軛提取物；3）、固相萃取純化蔬菜葉酸去軛提取物；4）、色譜柱分離蔬菜中包括四氫葉酸，5-甲基–四氫葉酸，5-甲酰–四氫葉酸和葉酸在內(nèi)的四種葉酸衍生物；5）、葉酸定量測定。采用本發(fā)明的方法可以同步測定蔬菜中總?cè)~酸及不同葉酸衍生物的含量。

1.同步定量測定蔬菜中總?cè)~酸及其衍生物含量的方法，其特征是依次包
括以下步驟：
1）、提取蔬菜中葉酸：
利用含有抗壞血酸和二巰基丙醇的0.1?M磷酸緩沖液煮沸提取蔬菜中
的葉酸，冷卻并離心后，得上清液；所述上清液為蔬菜葉酸提取物；
所述含有抗壞血酸和二巰基丙醇的0.1?M磷酸緩沖液為：在每升0.1?
M磷酸緩沖液中含有10g的L(+)-抗壞血酸和10ml的二巰基丙醇；
2）、添加葉酸軛合酶：
在步驟1）所得的蔬菜葉酸提取物中加入老鼠血清軛合酶，于35~39°
C孵育，然后煮沸從而終止老鼠血清軛合酶的活性；離心后取上清液，
所述上清液為蔬菜葉酸去軛提取物；
3）、固相萃取純化蔬菜葉酸去軛提取物：
強陰離子交換物質(zhì)的固相萃取柱活化后，加入步驟2）所得的蔬菜葉酸
去軛提取物，經(jīng)去離子水淋洗，最后用0.1M乙酸鈉緩沖液進行洗脫；
從0.1M乙酸鈉緩沖液洗脫開始，收集含有葉酸衍生物的純化液；
4）、色譜柱分離蔬菜中包括四氫葉酸，5-甲基–四氫葉酸，5-甲酰–
四氫葉酸和葉酸在內(nèi)的四種葉酸衍生物：
采用250?×?4.6?mm?、粒徑為5?mm的?Zorbax?SB色譜柱作為分
離柱、乙腈-磷酸緩沖液作為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫程序為0
min，6∶94；5min，6∶94；20?min，?25∶75；?2min，25∶75；
1?min，6∶94；14?min，6∶94；流速：0.4?mL/min，柱溫度23?
°C；含有葉酸衍生物的純化液的進樣量：20μL；
5）、葉酸定量測定：
采用高效液相色譜紫外檢測器/熒光檢測器對Zorbax?SB色譜柱分離到
的葉酸的各種衍生物進行定量測定，紫外檢測器檢測波長為290?nm時
記錄峰面積，按外標法以峰面積得出葉酸含量，熒光檢測器激發(fā)波長
290?nm?/發(fā)射波長360?nm時記錄峰面積，按外標法以峰面積得出四
氫葉酸，5-甲基–四氫葉酸，5-甲酰–四氫葉酸和葉酸含量，再根據(jù)
葉酸衍生物四氫葉酸，5-甲基–四氫葉酸，5-甲酰–四氫葉酸和葉酸
含量及其對應(yīng)的分子量計算總?cè)~酸含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同步定量測定蔬菜中總?cè)~酸及其衍生物含量的方
法，其特征是所述步驟1）中：將蔬菜樣品研磨成粉末，然后加入含有
抗壞血酸和二巰基丙醇的0.1?M磷
酸緩沖液，在惰性氣體的保護下，于95~105℃煮沸10~14分鐘，接著冰
浴冷卻后離心，得上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同步定量測定蔬菜中總?cè)~酸及其衍生物含量的方
法，其特征是：所述步驟2）中：在每5?mL?蔬菜葉酸提取物中加入
170~180μL的老鼠血清軛合酶。