本發明涉及一種基于直接競爭熒光免疫法定量檢測葉酸功能化二氧化硅靶向納米藥物載體的方法，結合抗原、抗體反應的特異性與熒光的敏感性對SiO2?FO納米粒子進行了定量檢測分析。步驟包括：制備SiO2?FO包被抗原和免疫原，將免疫原注射到動物體內得到高特異性抗體，再將FITC標記上抗體制成熒光抗體，然后建立直接競爭熒光免疫法準確測定了SiO2?FO的含量。本發明檢測方法操作簡單、靈敏度高、特異性強、可實現高通量檢測。

1.一種基于直接競爭熒光免疫法定量檢測葉酸功能化二氧化硅（SiO₂-FO）靶向納米藥物載體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：a、SiO₂-FO包被抗原和免疫原的制備；b、抗SiO₂-FO抗體的制備；所述抗SiO₂-FO抗體的效價為1:64000；c、熒光抗體的制備；d、將SiO₂-FO包被抗原經包被液稀釋后包被于酶標板中，封閉、加入不同濃度的SiO₂-FO標準品，以FITC標記的抗SiO₂-FO抗體作為一抗，建立直接競爭熒光免疫分析定量檢測SiO₂-FO；e、以SiO₂-FO標準品濃度的對數為橫坐標，熒光強度值為縱坐標繪制標準曲線SiO₂-FO標準品濃度的對數為橫坐標，熒光強度值為縱坐標繪制標準曲線；所述標準曲線的線性方程為A=12434.4-1136.7logC，其中A為熒光強度值，C為SiO₂-FO濃度；所述步驟a具體包括以下步驟：a-1、稱取10~20mg SiO₂-FO溶于1~2mL PBS溶液中，磁力攪拌1~2h即得到水溶性的SiO₂-FO溶液；a-2、稱取10~20mg OVA溶于2~4mL PBS溶液中,并在攪拌下加入步驟a-1得到的SiO₂-FO溶液，混合均勻后再滴加80~200μL 25%戊二醛溶液，25~28℃下避光攪拌2~5h；將反應液置于透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO₂-FO包被抗原，其濃度為2~4mg/mL；a-3、稱取10~20mg BSA溶于2~4mL PBS溶液中，并在攪拌下加入步驟a-1得到的SiO₂-FO溶液，混合均勻后再滴加80~200μL 25%戊二醛溶液，25~28℃下避光攪拌2~5h；將反應液置于透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO₂-FO免疫原，其濃度為2~4mg/mL。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，透析袋的截留分子量為8000~14000Da。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，水溶性的SiO₂-FO溶液濃度為5~15mg/mL。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟b具體包括以下步驟：b-1、首次免疫：將SiO₂-FO免疫原與弗氏完全佐劑等體積比混合后，采用背部皮下多點注射的方式注射到大白兔體內，注射8~10個點，注射量為1~2mL/只；首次免疫三周后進行加強免疫；b-2、加強免疫：將SiO₂-FO免疫原與弗氏不完全佐劑等體積比混合后，采取同樣的方式注射到大白兔體內，注射8~10個點，注射量為1~2mL/只；此后每兩周進行再次加強免疫，中間周進行耳靜脈采血測血清效價，直到效價達到1:64000，再進行最后一次加強免疫，并在免疫一周后從動物頸動脈采血，靜置析出抗血清并進行純化，得到抗SiO₂-FO抗體，其濃度為15~20mg/mL。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟c具體包括以下步驟：c-1、取純化后的抗SiO₂-FO抗體，用碳酸鹽緩沖液稀釋至每毫升內含蛋白8~15mg，制得抗體溶液；c-2、將異硫氰酸熒光素（FITC）溶解在碳酸鹽緩沖液中，制成濃度為2mg/mL的FITC溶液；c-3、在25~28℃下將FITC溶液緩慢加入步驟c-1得到的抗體溶液中，磁力攪拌4~6h；c-4、將步驟c-3得到的溶液用葡聚糖凝膠進行過濾純化，得到FITC標記的抗SiO₂-FO抗體。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟c-3中，FITC溶液與抗體溶液的體積之比為1:10。7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟d具體包括以下步驟：d-1、包被：用包被緩沖液將SiO₂-FO包被抗原稀釋80倍，包被96孔酶標板，每孔100μL，4℃冰箱過夜；d-2、封閉：甩干，PBST溶液洗滌3次，每次3~5min，洗去未被結合上的SiO₂-FO包被抗原,加入1wt% 酪蛋白，每孔200μL進行封閉，37℃烘箱溫育1~2h；d-3、加樣競爭：甩干，PBST溶液洗滌3次，每次3~5min，洗去多余的封閉液,然后將50μL不同濃度的SiO₂-FO標準品和50μL FITC標記的抗SiO₂-FO抗體分梯度加入各孔中，使之發生競爭反應，37℃烘箱溫育2~4h；d-4、檢測：甩干，PBST溶液洗滌3次，每次3~5min，除去游離態的SiO₂-FO標準品或抗體結合物,用多功能酶標儀測定各孔在激發波長為485nm，發射波長為528nm處的熒光強度值。