一種頭孢氨芐殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中設(shè)置有以下成分：包被有包被原的酶標(biāo)板，所述包被原為頭孢氨芐與載體蛋白的偶聯(lián)物；頭孢氨芐特異性抗體；酶標(biāo)記物；頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0μg/L-5μg/L；底物顯色液；終止液；濃縮洗滌液；和樣品稀釋液。本發(fā)明的檢測動物性食品中頭孢氨芐殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測牛奶及動物組織(豬、牛的肌肉、肝臟、腎臟等)中頭孢氨芐的殘留量，樣品前處理過程簡單，能同時檢測大批樣品。測定方法簡單、省時，整個檢測過程只需1.5小時就可以完成。

1.一種頭孢氨芐殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：
(1)蛋白偶聯(lián)抗原的合成：
A.頭孢氨芐免疫抗原的合成：將頭孢氨芐和牛血清白蛋白采用碳二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到
免疫抗原；具體操作如下：取頭孢氨芐15mg溶于5mL?0.01mol/L，pH?7.4的PBS中，加入
25mg碳二亞胺和10mgN-羥基琥珀酰亞胺攪拌30分鐘，取牛血清白蛋白10mg溶于活化的
頭孢氨芐溶液中，25℃攪拌反應(yīng)2小時，再4℃反應(yīng)過夜；4℃條件下，用PBS透析3天，得
到頭孢氨芐免疫抗原，分裝凍存；
B.頭孢氨芐包被抗原的合成：將頭孢氨芐和卵清蛋白采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗
原；具體操作如下：取頭孢氨芐10mg溶于5mL?0.01mol/L，pH?7.4的PBS中，加入1％戊二
醛溶液攪拌30分鐘，取卵清蛋白30mg溶于1mL?PBS，加入到活化的頭孢氨芐溶液中，25℃
攪拌反應(yīng)2小時，4℃反應(yīng)過夜；4℃條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐包被抗原，分
裝凍存；
(2)單克隆抗體的制備：
A.動物免疫：將合成的免疫原與等量的弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射8周齡雌性BALB/C
小鼠，劑量為100μg/只；然后以100μg/只的劑量加弗氏不完全佐劑腹腔注射加強(qiáng)免疫3次，
間隔2周；
B.細(xì)胞融合和克隆化：取免疫小鼠的脾細(xì)胞，按5∶1比例與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，制
備雜交瘤細(xì)胞；采用有限稀釋法篩選能夠穩(wěn)定分泌頭孢氨芐單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，擴(kuò)
大培養(yǎng)后液氮凍存；
C.單克隆抗體的制備與純化：使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑0.5
mL/只，5天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞10⁶個/只，7天后取小鼠腹水，經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純
化，分裝，-20℃保存；
(3)試劑盒的制備：
A.酶標(biāo)板的制備：
用包被緩沖液將頭孢氨芐包被抗原稀釋成0.5-1μg/mL，每孔加入100μL，37℃溫育2h再
4℃過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌4次，每次30秒，拍干，然后在每孔
中加入200μL封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存；
B.所用試劑的配置：
1)頭孢氨芐系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為0μg/L，0.05μg/L，0.1μg/L，0.5μg/L，1μg/L，
5μg/L；
2)蛋白濃度為0.1-1mg/L的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG；
3)蛋白濃度為0.1-1mg/L的頭孢氨芐單克隆抗體；
4)底物顯色液由A液和B液組成，A液為用0.1mol/L?pH5.0的檸檬酸緩沖液配制成0.1-1
mg/mL的過氧化脲溶液，B液為四甲基聯(lián)苯胺先用無水乙醇配制2mg/mL的溶液，再用0.1
mol/L?pH5.0的檸檬酸緩沖液配制成0.1-1mg/mL溶液；
5)終止液為1-2mol/L硫酸；
6)濃縮洗滌液為pH7.4含0.8-1.2％吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液；
7)樣品稀釋液為0.1％-1％牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。