本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種隱球菌活力的檢測試劑盒，試劑盒采用兩種熒光染料分別標(biāo)記真菌菌體和真菌活力，利用該試劑盒、并借助普通流式細(xì)胞儀的輔助，可快速準(zhǔn)確分析腦脊液隱球菌數(shù)量和活力，本發(fā)明還提供了一種利用上述的隱球菌活力檢測試劑盒的檢測方法，對患者預(yù)后判斷和臨床治療方案制定具有重要指導(dǎo)意義。

1.一種隱球菌活力檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒是用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測腦脊
液、肺泡灌洗液中隱球菌活力和數(shù)量，該試劑盒包括下列試劑：
檢測液A：3.5％w/v的熒光增白劑，pH值為10；
檢測液B：1％w/v的核酸染色劑碘化丙啶；
稀釋液C：PBS稀釋緩沖液，pH值為7.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種隱球菌活力檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測液A：
1.75mg熒光增白劑溶于0.5ml雙蒸水，NaOH調(diào)節(jié)pH至10，避光管保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種隱球菌活力檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測液B：
0.5mg碘化丙啶溶于0.5ml雙蒸水中，避光保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種隱球菌活力檢測試劑盒，其特征在于，所述的稀釋
液C：磷酸氫二鈉2.6g，磷酸二氫鈉0.43g，氯化鈉8.18g，定容到1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種隱球菌活力檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒，包
括：1ml的檢測液A、1ml的檢測液B和50ml的稀釋液C。
6.一種利用權(quán)利要求1所述的隱球菌活力檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，該方法
包括如下步驟：
A、將含隱球菌的樣本懸液離心1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，去上清；用稀釋液C將沉淀稀釋至
10⁶個(gè)/ml，制成待測標(biāo)本；
B、將待測標(biāo)本振蕩后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測調(diào)零，調(diào)零后的標(biāo)本中加入檢測液A，上機(jī)檢
測，并進(jìn)行圈門；
C、在步驟B的樣本中加入檢測液B，再次上機(jī)檢測，至少記錄10000個(gè)細(xì)胞并加以記錄和
統(tǒng)計(jì)分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟B中采用FL1和FL4通道檢
測熒光。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟C獲得流式細(xì)胞數(shù)據(jù)，用
Flowjo分析軟件，在PI_Cy5-A/VioBlue-A雙參數(shù)點(diǎn)圖中進(jìn)行設(shè)門調(diào)整。
9.一種利用權(quán)利要求1所述的隱球菌活力檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，該方法
包括下述步驟：
步驟一試劑制備：
1.1、檢測液A為3.5％w/v的熒光增白劑保存液：1.75mg熒光增白劑溶于0.5ml雙蒸水，
NaOH調(diào)節(jié)pH至10，避光管保存；
1.2、檢測液B為1％w/v的碘化丙啶保存液：0.5mg碘化丙啶溶于0.5ml雙蒸水中，避光管
保存；
1.3、稀釋液C為：磷酸氫二鈉2.6g，磷酸二氫鈉0.43g，氯化鈉8.18g，定容到1000ml，調(diào)
節(jié)pH至7.2，取50ml分裝；
步驟二樣本標(biāo)記與檢測：
將腦脊液樣本1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液，加入1.3中稀釋液C200μl，重懸，制成待
測標(biāo)本；
步驟三采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測：
按照流式細(xì)胞儀的操作規(guī)程，對步驟二中制備的待測標(biāo)本進(jìn)行測試，并用Flowjo分析
軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，
3.1將重懸的待測標(biāo)本振蕩后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，采用二維點(diǎn)圖形式進(jìn)行結(jié)果分析：先
建立FSC/SSC點(diǎn)圖，排除細(xì)胞碎片，選取R1區(qū)；
3.2在3.1的樣本中加入5μl檢測液A，再次上機(jī)檢測，吸樣量為50μl，F(xiàn)L1-A/FL4-A雙通
道檢測；
3.3在3.2的樣本中加入5μl檢測液B，再次上機(jī)檢測，獲得流式細(xì)胞數(shù)據(jù)，用Flowjo分析
軟件，在PI_Cy5-A/VioBlue-A雙參數(shù)點(diǎn)圖中進(jìn)行調(diào)整。