本發(fā)明公開了一種透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒及其制備方法，用來測(cè)定人血清及其他體液中的透明質(zhì)酸的含量，其組份包括透明質(zhì)酸校準(zhǔn)品、透明質(zhì)酸-巰基磁珠連接物試劑、酶結(jié)合物、化學(xué)發(fā)光底物和清洗液。本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法，本發(fā)明試劑盒將透明質(zhì)酸包被巰基磁珠和化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，使反應(yīng)處在近均相的體系中，使反應(yīng)時(shí)間較其他透明質(zhì)酸試劑盒明顯縮短，并且試劑盒的性能指標(biāo)更為優(yōu)異。

1.一種制備透明質(zhì)酸化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟：
1)配制透明質(zhì)酸校準(zhǔn)品；
2)將透明質(zhì)酸連接到巰基磁珠上制備連接物，用磁珠緩沖液稀釋連接物到一定濃度，制備出連接物
試劑；
3)用酶標(biāo)記透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，制備酶結(jié)合物；
4)配制化學(xué)發(fā)光底物；
5)配制清洗液；
6)分裝以上各試劑，組成成品；
所述連接物試劑的制備過程包括以下步驟：
a1、準(zhǔn)確稱取透明質(zhì)酸5mg，溶解于純水中，終濃度為0.5mg/ml；
a2、在上一步的透明質(zhì)酸溶液中加入1M?NaOH溶液使溶液pH達(dá)到10±0.1，室溫水解8-10小時(shí)，將
透明質(zhì)酸分子中的酰胺基進(jìn)行水解，使其暴露出伯氨基(-NH₂)基團(tuán)，反應(yīng)過程中充分混勻；
a3、將反應(yīng)后的透明質(zhì)酸溶液用透析袋透析2小時(shí)，除去溶液中的NaOH，然后濃縮至約2mg/ml；
a4、按照如下方法配制pH＝7.0的50mmol/l的磷酸鹽緩沖液：稱取NaH₂PO₄·H₂O?2.69g，Na₂HPO₄·2H₂0
5.43g，NaCl?5.85g，加入800ml純化水，用1M鹽酸或氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.0±0.1，定容至1000ml
后復(fù)測(cè)pH值，使之處于7.0±0.1，0.22μm過濾后于2-8℃保存；
a5、配制10mg/ml的磺基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷(SMCC)，用二甲基亞砜(DMSO)
溶解；
a6、將濃縮后的透明質(zhì)酸溶液中加入50μl?10mg/ml的磺基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己
烷(SMCC)進(jìn)行活化，室溫反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)過程中充分混勻；
a7、量取5mg巰基磁珠，將巰基磁珠放置于磁架上靜置2分鐘，移除上清，用pH＝7.0的50mmol/l磷
酸鹽緩沖液洗滌三次后加入磷酸鹽緩沖液保存，使磁珠濃度為25mg/ml；
a8、將活化后的透明質(zhì)酸溶液加入清洗后的巰基磁珠中，并將反應(yīng)液中磁珠濃度調(diào)整為2mg/ml，室
溫反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)過程中充分混勻；
a9、按照如下方法配制磁珠緩沖液：稱取Tris堿12.11g，NaCl?8.78g，0.5ml吐溫-20，1g疊氮鈉，
加入800ml純化水，用4mol/l鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至7.4±0.1，加入1g干酪素鈉，定容至1000ml后復(fù)測(cè)
pH值，使之處于7.4±0.1，0.22μm過濾后于2-8℃保存；
a10、反應(yīng)完成后移除上清，用50mmol/l磷酸鹽緩沖液洗滌三次后加入1ml磁珠緩沖液進(jìn)行保存，使
用時(shí)用磁珠緩沖液稀釋100倍即為工作液，濃度為0.05mg/ml。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶結(jié)合物的制備過程包括以下步驟：
b1、取堿性磷酸酶0.5mg，將濃度調(diào)整為5mg/ml；
b2、稱取2mg磺基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷(SMCC)，用二甲基亞砜(DMSO)進(jìn)行
溶解，終濃度為10mg/ml，加入5μl至堿性磷酸酶溶液中，17-23℃反應(yīng)20分鐘；
b3、用分子篩層析法根據(jù)分子量的差別對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行純化，收集活化后的堿性磷酸酶溶液；
b4、取純品HABP?0.5mg，加入到活化后的堿性磷酸酶溶液中，2-8℃反應(yīng)4小時(shí)，最后用分子篩層析
法將酶標(biāo)記的HABP提純出來；
b5、酶結(jié)合物緩沖液配制：稱取Tris12.11g，NaCl?8.78g，5g甘油，1g疊氮鈉，加入800ml純化水，
用4mol/l鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至7.4±0.1，加入10gBSA，定容至1000ml后復(fù)測(cè)pH值，使之處于7.4±0.1，
0.22μm過濾后于2-8℃保存；
b6、將結(jié)合物用酶結(jié)合物緩沖液稀釋至酶標(biāo)記的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白濃度為1μg/ml即為工作液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物的配制包括以下步驟：
準(zhǔn)確稱取AMPPD(3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽)1g，Tris
24g，氯化鈉160g，CTAC?0.0255g，純化水定溶至1000ml，調(diào)整化學(xué)發(fā)光底物溶液pH值為9.7±0.05。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述校準(zhǔn)品的制備過程包括以下步驟：
c1、校準(zhǔn)品緩沖液的配制：
稱取Tris堿6.06g，NaCl?8.78g，1g疊氮鈉，加入800ml純化水，用4mol/l鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至
7.0±0.1，加入5g?BSA，定容至1000ml后復(fù)測(cè)pH值，使之處于7.0±0.1，0.22μm過濾后于2-8℃保存；
c2、將HA純品粉末用校準(zhǔn)品緩沖液溶解，配制成為100μg/ml的濃溶液，隨后依次稀釋出5個(gè)濃度，
分別為：20，80，320，640，1600ng/ml，加上0點(diǎn)，共6個(gè)濃度的校準(zhǔn)品梯度值。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述清洗液的制備過程包括以下步驟：
稱取Tris?1211.4mg，NaCl?9g，吐溫-20?1g，加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用1M鹽酸溶液
調(diào)整溶液pH值到8.0±0.1，補(bǔ)加純化水定容至1000ml，過濾后混勻待用。