本發明公開了用于檢測百合無癥病毒的引物、試劑盒及檢測方法，本發明所述引物的序列為：LSV Primer-1:5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'，LSV Primer-2:5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'。本發明所述的試劑盒及檢測方法中包含上述引物LSV Primer-1和LSV Primer-2。利用該引物及檢測方法檢測百合無癥病毒準確性高，特異性強、靈敏性高。

1.一種用于檢測百合無癥病毒的引物，其特征在于：?引物序列：?LSV?Primer-1:5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'，?LSV?Primer-2:5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'。?2.一種檢測百合無癥病毒的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有：?其中所述的LSV?Primer-1序列為5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'；所述的LSV?Primer-2序列為5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'。?3.根據權利要求2所述的一種檢測百合無癥病毒的試劑盒，其特征在于所述的Enzyme?Mix包括反轉錄酶、PCR擴增用的Taq聚合酶、RNA酶抑制劑；所述的Buffer包括MgCl₂25mM、dNTPs10mM；所述Positive?Control為百合無癥病毒的核酸；所述RNase?Free?dH₂O為除去RNA酶后的去離子水。?4.一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：?A、待測樣品RNA提取，得模板RNA溶液；?B、將步驟A中的模板RNA溶液反轉錄成cDNA，再采用引物LSVPrimer-1和LSV?Primer-2對進行PCR擴增，得PCR反應液；其中所述的LSV?Primer-1序列為5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'；所述的LSV?Primer-2序列為5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'；?C、取PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳分析；?D、若存在297bp的DNA條帶，則證明所檢測用品中帶有百合無癥病毒。?5.根據權利要求4所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟A中所述待測樣品RNA提取，具體包括如下步驟：?a1、選取0.1-0.2g表現可疑癥狀的百合葉片組織，同時用等量健康組織作為對照；將百合葉片組織加液氮冷凍，充分研磨后裝入1.5mL離心管中；?a2、在離心管中加入冰冷的400μL?RNA抽提液，顛倒混合均勻；?a3、臺式冷凍離心機4℃，12000g離心10min；?a4、取上清，加入400μL苯酚、氯仿、異戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、異戊醇的體積比為25:24:1，顛倒混合均勻；?a5、臺式冷凍離心機4℃，12000g離心10min；?a6、取上清，加入400μL氯仿、異戊醇的混合液，其中氯仿、異戊醇的體積比為24:1，顛倒混合均勻；?a7、臺式冷凍離心機4℃，12000g離心10min；?a8、取上清，加入1000μL無水乙醇和40μL3M醋酸鈉pH5.2，顛倒混合均勻；?a9、臺式冷凍離心機4℃12000g離心10min；?a10、留沉淀，用500μL70%冷乙醇洗滌一次，置于超凈工作臺上吹干，然后溶于20μL無RNA酶的水中。?6.根據權利要求4所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟B中所述模板RNA溶液反轉錄成cDNA，具體包括以下步驟：?在0.5mL離心管中加入去離子水9.5μL，加入總RNA2μL，Primer-2引物1μL，濃度為10mmol/L的dNTPs1μL，70℃水浴5min后立即置于冰上2min；然后3000rpm離心30s；再加入5×cDNA第一鏈合成緩沖液4μL，0.1mol/L?DTT1μL；RNase抑制劑1μL(30U)；M-MLV反轉錄酶1μL(20U)；37℃60min。?7.根據權利要求4所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟B中所述PCR擴增具體包括以下步驟：?在0.2mL離心管中加入10×PCR擴增緩沖液2.5μL，濃度為25mmol/L的MgCl₂2μL，濃度為10mmol/L的dNTPs1μL，Primer-11μM（50pmol），Primer-21μM（50pmol），cDNA第一鏈合成反應液2μL，加水至25μL，然后加入Taq聚合酶0.5μL(1U)；PCR循環條件：94℃變性3min；然后94℃1min，52℃1min，72℃1min，循環35次；最后72℃延伸10min；4℃保存反應產物。?8.根據權利要求4所述的一種檢測百合無癥病毒的檢測方法，其特征在于步驟C中所述瓊脂糖凝膠電泳分析具體包括以下步驟：?c1、用1×TAE緩沖液和瓊脂糖按1.5%的濃度配好，在微波爐中熔化均勻，冷卻至50-60℃；?c2、加入I核酸染料或濃度為1μg/mL的溴化乙錠,混合均勻，倒入凝膠平臺上，插上樣品梳；?c3、待凝膠凝固后，拔出梳子，加入適量的TAE緩沖；?c4、取1μL加樣緩沖液與5μL?PCR反應液混合均勻，然后分別將其和合適的DNA分子量標準物加入樣品孔中；?c5、接通電源進行電泳，電壓5V/cm；?c6、當加樣緩沖液中的溴酚藍遷移至足夠分離DNA片段時，停止電泳；將整個膠置于凝膠成像系統中觀察，并照像記錄。?