本發明涉及一種RNA pulldown方法及試劑盒。所述方法包含以下步驟：S1、磁珠預處理：使用BSA和寡核苷酸隨機引物封閉含鏈霉親和素的磁珠；S2、制備探針?磁珠復合物；S3、提取并預處理細胞全蛋白：向提取細胞全蛋白樣品中加入核糖核酸酶孵育，再加入磁珠孵育，收集上清；S4、pulldown；S5、RNP的收集。本發明具有如下有益效果：本發明通過預先使用BSA、寡核苷酸隨機引物封閉磁珠，降低了磁珠與蛋白、RNA的非特異性結合。本發明通過系統性核酸酶防護，防止核酸酶的污染，增加了實驗的穩定性和可靠性，重復性好，簡化了實驗流程。

1.一種RNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步驟：
S1、磁珠預處理：使用BSA和寡核苷酸隨機引物封閉鏈霉親和素標記的磁珠；
所述步驟S1磁珠預處理的方法為：用1mL 1×TES洗滌80μL鏈霉親和素標記的磁珠，去
除TES洗滌液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸隨機引物的1×TES，室溫孵育30min后
去除TES溶液；
所述TES中BSA的濃度為0.05-0.5wt%，寡核苷酸隨機引物的濃度為10-20μmol/L；
所述步驟S1中寡核苷酸隨機引物為20bp以內的DNA序列；
S2、制備探針-磁珠復合物：將步驟S1預處理的磁珠與生物素標記的RNA探針結合；
S3、提取并預處理細胞全蛋白：向提取的細胞全蛋白中加入脫氧核糖核酸酶孵育，再加
入未預處理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；
所述步驟S3中預處理細胞全蛋白的方法為：向1.5×10⁷個細胞提取獲得的細胞全蛋白
提取物中加入10μL DNase和3.2μL DNase Buffer，室溫溫和孵育1h；再加入40μL未預處理
的磁珠，4℃溫和旋轉30 min；收集上清液為預處理的細胞全蛋白；
S4、pulldown：將步驟S3收集的上清加入到步驟S2制備的探針-磁珠復合物中，加入脫
氧核糖核酸酶抑制劑和核糖核酸酶抑制劑孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制劑的NT2
buffer洗滌磁珠，得到蛋白-探針-磁珠復合物；
S5、RNP的收集：將步驟S4制得的蛋白-探針-磁珠復合物加入Urea CHAPS buffer孵育，
去除磁珠，收集上清即得RNP。
2.根據權利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步驟S2制備探針-磁珠
復合物的方法為：將含2-5μg生物素標記RNA探針的溶液在90℃放置2min，立即置于冰上
2min，加入50μLRNA structure buffer和20μL DEPC水，室溫放置20min制備得到二級結構
的RNA探針；將其加入預處理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃溫和旋轉混合30-60min，
去上清；用1×TES洗滌磁珠兩次，去除TES。
3.根據權利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步驟S3提取細胞全蛋白
的方法為：用PBS洗滌1.5×10⁷個細胞一次；加入975μLRIP Buffer、10μL PMSF溶液、10μL
protease inhibitor cocktail和5μL DTT溶液，勻漿15-20次；4℃、1500g離心15min，收集
上清即為細胞全蛋白提取物。
4.根據權利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步驟S4 pulldown的具
體方法為：將步驟S3制備的細胞全蛋白加入到探針-磁珠復合物中，并加入472.5μL NT2
buffer、5μL RNase inhibitor、15μg poly(dI?dC)、5μL 0.5 M EDTA溶液和2.5μL 0.5M
EGTA溶液；室溫溫和旋轉孵育2h，收集磁珠；加入974μL NT2 buffer、10μL PMSF溶液、10μL
protease inhibitor cocktail、5μL DTT溶液和1μL RNase inhibitor，洗滌磁珠，再重復
洗滌四次。
5.根據權利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步驟S5中RNP的收集方
法為：向蛋白-探針-磁珠復合物中加入40μL Urea CHAPS buffer，4℃孵育5-10h，收集上清
即為探針-蛋白復合物。