本發明涉及一種基于納米免疫磁珠?近紅外熒光標記法的結核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖(LMA)檢測試劑盒。本試劑盒中，以近紅外熒光染料標記靶向于LAM的單克隆抗體，靶向于LAM的多克隆抗體包被在納米磁珠表面。采用雙抗體夾心法原理，磁性分離結合物和游離物，采用便攜式高靈敏度低噪聲激發式熒光檢測儀檢測磁性結合物的熒光強度，從而檢測待檢樣品中LAM含量。本發明適用于臨床病理標本中的LAM檢測，具有快速、靈敏、抗雜散熒光干擾、發射熒光保存時間長的特點。

1.一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標記法的結核分枝桿菌LAM檢測試劑盒，其特征
在于：所述試劑盒由近紅外熒光染料標記的單克隆抗體、多克隆抗體包被的納米磁珠、磁性
分離器、蛋白標準品、緩沖液組成；其中，近紅外熒光染料標記的單克隆抗體為兔抗LAM；包
被納米磁珠的多克隆抗體為兔多抗LAM；建立LAM標準品梯度濃度和熒光發射值之間的工作
曲線，將所測得的發射熒光強度，代入方程即可完成樣品中目標多糖含量的定量檢測；
所述基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標記法的結核分枝桿菌LAM檢測試劑盒的制備方
法，步驟如下：
(1)制備近紅外熒光染料標記的LAM單克隆抗體；
將購自Thermofisher公司的Dylight800用pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋10倍，取1.4μL
與購自Mossman Associates Inc公司的濃度為1mg/ml、20μg兔抗LAM單克隆抗體輕柔混合
均勻后于室溫避光反應2小時；反應結束后，將標記產物放入透析袋中，4℃，PBS緩沖液透析
4小時；標記好的抗體溶液中添加終濃度為1.5％BSA和0.1％Tween20，疊氮化鈉0.1‰，4℃
保存；使用前將標記產物以PBS稀釋2000倍；
(2)LAM多克隆抗體的制備
1)LAM的提純：
將MTB H37RV接種在羅氏雞蛋培養基上，37℃培養3～4周，收取菌落置于5mlEP管中，
100℃水浴滅活2小時，用2ml的pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌2次，8000r/min、10min離心棄上
清；加入2ml氯仿∶甲醇＝2∶1混合液脫脂3次，8000r/min，10min離心棄上清；加入2ml的pH值
為7.4的PBS懸浮，冰浴超聲破碎：超聲10s，停10s，共30min，8000r/min，10min，離心取上清，
加入2ml40％的苯酚萃取，70℃，1小時，8000r/min，10min離心取上清，用蒸餾水透析2天，采
用SepHacryl S-100凝膠柱層析，用0.05mmol/L的NaCl溶液洗脫，流速0.5ml/min，用EP管收
集2ml/管；
2)LAM的定量：
取濃硫酸1ml，9％苯酚200μl，標本200μl，混勻后避光反應30分鐘，空白調零，以L-阿拉
伯糖為多糖標準，制作濃度范圍0.1～3.0mg/ml的標準曲線，測吸光度A₄₈₅值，直線回歸計算
標本中多糖含量；
3)LAM多克隆抗體制備：
以本實驗室制備的LAM為免疫原，委托江南大學食品學院代為制備LAM多克隆抗體，制
成后的抗體為兔抗LAM多克隆抗體，濃度為1mg/ml；
(3)制備LAM多克隆抗體包被的納米磁珠，購自武漢哇哇噻納技術開發有限公司北京生
物技術研究所；
1)納米磁珠的預處理：
輕輕混勻磁珠懸浮液，吸取0.01ml的25mg/ml懸浮液加入1.5ml EP試管中；再加入
0.1ml重蒸水，輕輕混勻并將試管架置磁板上，靜置2分鐘后吸取上清液；重復上述步驟1次；
加入1ml 0.1M、pH為5.0的乙磺酸溶液，重懸磁珠；
2)納米磁珠的活化
將上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗滌2次，棄上清；
臨用前配置終濃度為0.1M的MES，其內含EDC和NHS的濃度均為40g/L，加入上述兩種物
質后，置于振蕩器上充分混勻15分鐘，待用，用該液重懸磁珠；
用磁板吸附磁珠，棄上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，棄上清；
3)磁珠與蛋白的鏈接；
在已處理好的磁珠中加入50μL的濃度為1mg/ml的LAM多克隆抗體和pH值為5.5的500μL
PBS，混勻，室溫，置于搖床上持續震蕩，孵育2小時；
用pH5.5，0.05％Tween的PBS緩沖液清洗3次，棄上清；
加入1ml，0.1M，0.1％BSA Tris緩沖液，混勻，室溫，置于搖床上持續震蕩，孵育2小時；
加入1ml，pH5.5，0.05％Tween的PBS緩沖液，靜置2分鐘，棄上清；重復3次，加入1ml的pH＝
5.5的PBS緩沖液，棄上清，重復3次；棄上清時，試管需置于磁板上；
加入1ml，pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05％NaN₃的PBS緩沖液，待用；
(4)制備LAM系列標準品；
LAM，pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋至1、5、25、125、625ng/ml。