1.梅毒螺旋體IgM抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所
述梅毒螺旋體IgM抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒設有外包裝盒、濃縮洗滌液瓶、陰
性對照品瓶、陽性對照品瓶、生物素標記抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧
化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、反應終止液瓶、包被有重組抗原微
孔板；
濃縮洗滌液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照品瓶、生物素標記抗人IgM特異性片段μ鏈單
克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、反應終止
液瓶和包被有重組抗原微孔板裝在外包裝盒內；
濃縮洗滌液瓶內裝有濃縮洗滌液，陰性對照品瓶內裝有陰性對照品，陽性對照品瓶內裝
有陽性對照品，生物素標記抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體瓶內裝有生物素標記抗人
IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記親和素瓶內裝有辣根過氧化物酶標記
親和素，TMB顯色液A瓶內裝有TMB顯色液A，顯色液B瓶內裝有顯色液B，反應終止
液瓶內裝有反應終止液；
所述TMB顯色液A為3,3',5,5'-四甲基聯苯胺顯色液；
所述顯色液B為3％的過氧化氫溶液；
所述制備方法，包括以下步驟：
1)提取梅毒螺旋體Nichol株和Reiter株外膜蛋白進行雙向電泳后，轉移至硝酸纖維素
膜上，用梅毒血清進行免疫印跡實驗，獲得特征性的免疫印跡斑點，取對應的蛋白點進行質
譜分析，分別找出Nichol株和Reiter株具有較高免疫原性的外膜蛋白，并找出Nichol株特
有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白；
2)在梅毒螺旋體的全基因組序列中找出對應基因，設計引物并構建相應的表達載體，研
究不同誘導條件對重組目標蛋白在大腸桿菌中表達量的影響，獲得最佳誘導條件，大量擴增
目標蛋白，收集過表達的目標蛋白進行純化，純度高于90％后，進行后續研究；
3)將步驟2)候選抗原，通過免疫大鼠獲得其相應多克隆抗體，采用酶聯免疫方法測定
抗體滴度，并使用免疫印跡方法驗證這些重組抗原的免疫原性；
4)采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其
表達，得梅毒螺旋體重組抗原；
5)將步驟4)中的梅毒螺旋體重組抗原用包被緩沖液稀釋至20ug/mL，以每孔0.1mL
加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，風干；用0.01mmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液配制
的1.0％脫脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風干、消
毒、密封，得重組抗原包被微孔板；
6)以人IgM特異性片段μ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩定
分泌抗人IgM單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
7)將抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體與活化的生物素混合進行標記，透析去除未
結合的生物素，制備生物素標記抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體；
8)采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記，得辣根過氧化物酶標記親和素；
9)TMB顯色液A采用市售品；
10)顯色液B采用市售品；
11)配制溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0.05％，得濃縮洗
滌液；
12)配制2mmol/L的硫酸作為反應終止液；
13)由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋體抗體陰性對照品；
14)由梅毒患者的陽性血清配制梅毒螺旋體抗體陽性對照品；
15)將生物素標記抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記親和素、
TMB顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液、陰性對照品、陽性對照品分別裝在瓶
中，再將生物素標記抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、
TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、濃縮洗滌液瓶、反應終止液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照
品瓶以及包被有重組抗原微孔板裝入外包裝盒中，得到梅毒螺旋體IgM抗體生物素親和素酶
聯免疫檢測試劑盒。
2.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgM抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒的制備方
法，其特征在于所述濃縮洗滌液采用溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃
度為0.05％。
3.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgM抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒的制備方
法，其特征在于所述陰性對照品為梅毒螺旋體總抗體陰性對照品，由非梅毒感染的健康人群
血清配制而成。
4.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgM抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒的制備方
法，其特征在于所述陽性對照品為梅毒螺旋體總抗體陽性對照品，由梅毒患者的陽性血清配
制而成。
5.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgM抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒的制備方
法，其特征在于所述反應終止液為摩爾濃度2mmol/L的硫酸。
6.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgM抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒的制備方法，
其特征在于在步驟4)中，所述重組抗原為梅毒螺旋體致病株Nichol株高表達，而梅毒非致
病株Reiter株無表達。
7.如權利要求6所述梅毒螺旋體IgM抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒的制備方法，
其特征在于所述梅毒螺旋體致病株Nichol株為Treponemapallidumssp.pallidumstrainNichol；所述
梅毒非致病株Reiter株為Treponemapallidumssp.pallidumstrainReiter。
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