本發(fā)明公開了一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，收集開花第三天的花粉，用柱頭液制備含有CodA基因的農(nóng)桿菌侵染液，以開花第一天的熱帶睡蓮為受體進(jìn)行侵染，種子成熟后，用潮霉素篩選溶液進(jìn)行種子萌發(fā)培養(yǎng)和篩選，抗性植株育苗后進(jìn)行大田種植，露地越冬篩選抗凍植株，再以轉(zhuǎn)基因植株為父本，非轉(zhuǎn)基因熱帶睡蓮優(yōu)良單株作為母本進(jìn)行雜交，露地越冬篩選出耐寒優(yōu)良后代。本發(fā)明為徹底解決在溫帶地區(qū)熱帶睡蓮露地自然越冬問題奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)也將推動(dòng)熱帶睡蓮基因工程的發(fā)展。

1.一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，其特征在于包括以下步驟：(a)農(nóng)桿菌培養(yǎng)：將含有雙元植物表達(dá)載體pBS1305RdcodA的農(nóng)桿菌EHA105單克隆接種于含50mg·L^-1卡那霉素和25mg·L^-1利福平的YM培養(yǎng)基上，并進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)3天，用小塑料勺收集菌體；(b)花粉收集：選擇熱帶睡蓮花粉多的株系，采摘熱帶睡蓮株系上開花的花朵，所述花朵的柱頭盤中有柱頭液，將花朵插在盛有半瓶水的水瓶中，同一個(gè)株系的花朵放入一個(gè)瓶中，放置在人工氣候箱中，待第三天，將雄蕊花藥剪下，放置到已滅菌的培養(yǎng)皿中備用；(c)母本準(zhǔn)備：授粉前一天，準(zhǔn)備好第二天要開花的花蕾，并將花蕾套袋；(d)侵染：在熱帶睡蓮開花時(shí)，先用移液槍將所述柱頭液吸取到離心管中，再用小塑料勺將農(nóng)桿菌輕輕刮下放入盛有柱頭液的離心管中，用毛筆采集所述培養(yǎng)皿中的花粉，并將花粉放入離心管中，將農(nóng)桿菌、花粉和柱頭液在離心管中混合均勻，再用移液槍吸取打入柱頭盤；授粉后，在花柄上掛牌，套袋；待授粉后第三天，將袋子取下，等待種子成熟；(e)篩選：種子成熟后，用潮霉素篩選溶液進(jìn)行種子萌發(fā)培養(yǎng)和篩選；(f)PCR鑒定：待種子發(fā)芽長(zhǎng)沉水葉時(shí)，移栽到裝有消毒過土壤的塑料杯中，長(zhǎng)大后，取嫩葉提取基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，鑒定陽性植株；(g)大田種植及越冬：將陽性植株移栽到露地大田里，保持田間水位20cm以上過冬；(h)雜交及越冬篩選：以轉(zhuǎn)基因株系為父本，非轉(zhuǎn)基因熱帶睡蓮優(yōu)良單株作為母本，進(jìn)行雜交，收集種子、播種育苗、移栽及大田種植，露天越冬篩選抗凍優(yōu)良植株；在所述步驟(e)中，所述潮霉素的濃度為10mg·L^-1。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，其特征在于：在所述步驟(a)中，在進(jìn)行劃線培養(yǎng)時(shí)，每條農(nóng)桿菌劃線長(zhǎng)度為6cm。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，其特征在于：在所述步驟(a)中，所述農(nóng)桿菌劃線培養(yǎng)在YM培養(yǎng)基中的溫度為28℃。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，其特征在于：在所述步驟(b)中，所述人工氣候箱的溫度為25℃。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，其特征在于：在所述步驟(d)中，所述侵染工作的時(shí)間控制在熱帶睡蓮開花第一天早上。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，其特征在于：在所述步驟(d)中，在用移液槍將柱頭液取到離心管時(shí)，每使用一次換一個(gè)離心管。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，其特征在于：在所述步驟(d)中，在用小塑料勺將農(nóng)桿菌輕輕刮下放入盛有柱頭液的離心管時(shí)，每使用一次換一個(gè)小塑料勺。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，其特征在于：在所述步驟(d)中，在用移液槍吸取打入柱頭盤時(shí)，每使用一次換一個(gè)槍頭。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育耐寒熱帶睡蓮的方法，其特征在于：在所述步驟(d)中，在農(nóng)桿菌、花粉和柱頭液在離心管中混合均勻時(shí)，每毫升注頭液加2條農(nóng)桿菌。