本發明涉及一種水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒及其檢測方法，專用于水仙遲季黃化病毒的檢測。該試劑盒包括：外側上游引物、外側下游引物、內側上游引物、內側下游引物、RTBuffer、RNA酶抑制因子、反轉錄酶、dNTPs、PCR Buffer、Mgcl、Taq DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和RNase-free ddHO。本發明根據水仙遲季黃化病毒基因序列設計特異性引物，利用巢式RT-PCR技術對水仙遲季黃化病毒進行檢測。首先以提取的RNA為模板反轉錄合成cDNA，利用cDNA為模板進行第一輪PCR擴增，再以第一輪PCR產物為模板進行第二輪PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現大小為539bp的特異性目的片段，則判定檢測的病毒為水仙遲季黃化病毒。本發明具有特異性強、靈敏度高、準確性好、檢測時間短的顯著優點，適用于進出境口岸及農業生產上水仙遲季黃化病毒的快速檢測和監測。

1.一種水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：1）外側上游引
物：10μmol/L，引物序列為5’-CCACTTGAAGTCTATCACCA-3’；2）外側下游引物：10μmol/L，
引物序列為5’-CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3’；3）內側上游引物：10μmol/L，引物序列為
5’-ATCACATACACACCACGACA-3’；4）內側下游引物：10μmol/L，引物序列為
5’-GTGTGTCTCTCCGTGTTCTC-3’；5）RT?Buffer：5×；6）RNA酶抑制因子：40U/μL；7）
反轉錄酶：200U/μL；8）dNTPs：10mmol/L；9）PCR?Buffer：10×；10）Mgcl₂：25mmol/L；
11）Taq?DNA聚合酶：5U/μL；12）水仙遲季黃化病毒的陽性對照樣品；13）不含水仙遲季
黃化病毒的陰性對照樣品；14）RNase-freeddH₂O。
2.利用權利要求1所述的水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括
以下步驟：
1）反轉錄反應：在PCR管中加入待測樣品總RNA?2μL、濃度為10μmol/L的外側下游引
物1μL和RNase-free?ddH₂O?5μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列試劑：5×RT
Buffer?2.5μL、濃度為10mmol/L?dNTPs?1μL、濃度為200U/μL反轉錄酶0.5μL、濃度為40U/μL
RNA酶抑制因子0.5μL。42℃水浴60min，70℃水浴10min后自然冷卻至室溫，合成cDNA；
2）第一輪PCR反應：取步驟1）合成的cDNA?3μL，按每管加濃度為5U/μL?Taq?DNA聚
合酶0.5μL、濃度為10mmol/L?dNTPs?0.5μL、10×PCR?Buffer?2.5μL、濃度為25mmol/L?MgCl₂
2μL、濃度為10μmol/L外側上游引物1μL、濃度為10μmol/L外側下游引物1μL、RNase-free?
ddH₂O14.5μL，使反應總體積為25μL；混合后的反應液，94℃預變性3min,然后94℃變性
30s、56℃退火45s、72℃延伸1min，如此共35個循環，最后一個循環結束后72℃繼續延
伸10min，反應結束；
3）第二輪PCR反應：取第一輪PCR反應產物0.1μL，按每管加濃度為5U/μL?Taq?DNA
聚合酶0.5μL、濃度為10mmol/L?dNTPs?0.5μL、10×PCR?Buffer?2.5μL、濃度為25mmol/L?MgCl₂
2μL、濃度為10μmol/L內側上游引物1μL、濃度為10μmol/L內側下游引物1μL、RNase-free?
ddH₂O?17.4μL，使反應總體積為25μL；混合后的反應液，94℃預變性3min,然后94℃變性
30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30個循環，最后一個循環結束后72℃繼續延
伸10min，反應結束；
4）PCR擴增產物電泳檢測：第二輪PCR反應結束后，取產物10μL用1.5%瓊脂糖凝膠
電泳進行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統上觀察并記錄實驗結果；含有水仙遲季黃化
病毒樣品的電泳檢測結果為在539bp處出現明亮的DNA條帶。