本發明屬于生物技術領域，涉及一種番茄病害的檢測方法，主要針對番茄的三種重要種傳病原馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和煙草環斑病毒的同時檢測。一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒，其主要特點在于包括以下組分：RT-PCR buffer；馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上下游引物，鳳果花葉病毒PepMV上下游引物，煙草環斑病毒TRSV上下游引物；反轉錄酶及DNA聚合酶Mix；無RNA酶的去離子水；馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和煙草環斑病毒無侵染活性的陽性對照。本發明的優點是能同時檢測番茄3種重要種傳病原，快速準確，避免了常規PCR檢測的重復操作。

1.一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘
塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒，其特征在于包括以下組分：
RT-PCR?buffer，2×RT-PCR?buffer，100-250μL；RT-PCR擴增引物為
馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上游引物，濃度為10μmol/L，10-30μL；馬
鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd下游引物，濃度為10μmol/L，10-30μL；鳳果
花葉病毒PepMV上游引物，濃度為10μmol/L，10-30μL；鳳果花葉病毒PepMV
下游引物，濃度為10μmol/L，10-30μL；煙草環斑病毒TRSV上游引物，濃
度為10μmol/L，10-30μL；煙草環斑病毒TRSV下游引物，濃度為10μmol/L，
10-30μL；反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20μL；無RNA酶的去離子水，100
μL-1mL；陽性對照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd、鳳果花葉病毒PepMV
和煙草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照各20-60μL；所述的RT-PCR
擴增引物為：
馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上游引物為：5′
-ATTCCCGCCGAAACAGG-3′；
PSTVd下游引物為：5′-CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3′；鳳果花葉
病毒PepMV上游引物為：5′-ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3′；PepMV
下游引物為：5′-AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3′；煙草環斑病毒
TRSV上游引物為：5′-CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3′；TRSV下游引物
為：5′-ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3′。
2.一種番茄種傳病原多重PCR檢測方法，其特征在于包括有：
1)總核酸提取：
2)RT-PCR反應體系為50μL，其中2×RT-PCR?buffer?25μL，RT/Taq?
Mix1.0-2.0μL，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上游引物5′-
ATTCCCGCCGAAACAGG-3′10μmol/L?0.6-1.6μL，PSTVd下游引物5′-
CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3′10μmol/L?0.6-1.6μL；鳳果花葉病
毒PepMV上游引物5′-ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3′10μmol/L?0.2-
1.0μL；PepMV下游引物為：5′-AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3′10μ?
mol/L?0.2-1.0μL；煙草環斑病毒TRSV上游引物5′-
CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3′10μmol/L?0.2-1.0μL；TRSV下游引物5′
-ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3′10μmol/L?0.2-1.0μL；總RNA模板2.5-
8μL，滅菌去離子水補足反應總體積；
3)RT-PCR反應條件為：
cDNA合成：50℃30min，1個循環；
PCR擴增：94℃預變性3min；94℃變性30s，50℃退火45s，72℃
延伸1min，35個循環；最后72℃延伸10min；
4)RT-PCR擴增產物電泳檢測：用TAE電泳緩沖液制備1.5％瓊脂糖凝
膠，在室溫下進行水平電泳；加10μL
PCR擴增產物，以健康番茄總核酸的反轉錄PCR產物為陰性對照，以DL?1000
Marker為標準分子量；100V/80mA下電泳30min，用SYBR?Safe代替EB染色，
用凝膠成像系統觀察并拍照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒擴增產物為一條163bp
的條帶，鳳果花葉病毒擴增產物為一條625bp的條帶，煙草環斑病毒擴增產
物為一條348bp的條帶。
3.如權利要求2所述的番茄種傳病原多重PCR檢測方法，其特征在于所
述的核酸提取包括有如下步驟：
(1)取感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒的
番茄葉片；稱取0.1g感染病毒樣品組織倒在潔凈的研缽內，加液氮研磨
成粉末狀；
(2)移入1.5mL離心管中，然后加入1mL的TRIzol，劇烈振蕩3min
以上；
(3)在4℃下，12?000rpm離心10min以除去不溶成分，將上清
液轉入另一新的1.5mL離心管中；
(4)在室溫下靜置5min，加0.2mL氯仿/mL?TRIzol，劇烈振蕩15s，
然后在室溫下靜置15min，再于4℃、12?000rpm的條件下離心15min；
(5)將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇/mL
TRIzol，上下顛倒混勻，室溫靜置15min；
(6)4℃、12?000rpm離心10min；
(7)棄上清，加入75％的乙醇洗滌沉淀，然后4℃、7?500rpm離心
2min，棄乙醇；
(8)沉淀在室溫下干燥10min或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min，加
入30μL無RNase水溶解，-70℃保存備用。