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一種豬病毒基因芯片及其檢測方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2022-01-17
  • 技術成熟度:可以量產
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201110459083.7 
  • 技術(專利)名稱 一種豬病毒基因芯片及其檢測方法 
  • 項目單位 北京農學院
  • 發明人 穆祥,董虹,張濤,姜代勛,胡格,段慧琴,張巖,王建舫,李佳 
  • 行業類別 中藥材獲取-動植物采集
  • 技術成熟度 可以量產
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 趙學坤
  • 發布時間 2022-01-17  
  • 01

    項目簡介

    本發明提供一種豬病毒基因芯片及其檢測方法。所述的基因芯片包括固定在基質載體上的探針,所述的探針為選自以下病毒的特征片段:古典豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合病毒(PRRSV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV)、豬細小病毒(PPV)。本發明檢測的病毒種類多樣,基本涵蓋了常見豬病毒;采用隨機引物PCR、多重PCR并進行標記,避免了凝膠電泳對PCR結果進行檢測容易導致的假陽性,實現在短時間內高通量的準確檢測;本發明的基質載體為經過醛基化處理的玻璃片,因此有利于探針和靶標的結合,且不會給檢測帶來較大的噪音。
    展開
  • 02

    說明書

    1.一種豬病毒基因芯片,其特征在于:所述的基因芯片包括固定在基質載體上的探針,所述的探針包括以下病毒的特征片段:古典豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合病毒(PRRSV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV)、豬細小病毒(PPV);所述的探針由Hex、PC、NC、PRRSV-1、PRRSV-2、PRRSV-3、CSFV-1、CSFV-2、PCV1-1、PCV2-1、PCV2-2、PCV-1、PCV-2、PRV-2、PPV-2組成,其探針的核苷酸序列分別如序列表SEQ?ID?No:?1、SEQ?ID?No:?2、SEQ?ID?No:?3、SEQ?ID?No:?4、SEQ?ID?No:?5、SEQ?ID?No:?6、SEQ?ID?No:?10、SEQ?ID?No:?11、SEQ?ID?No:?23、SEQ?ID?No:?26、SEQ?ID?No:?27、SEQ?ID?No:?29、SEQ?ID?No:?30、SEQ?ID?No:?33、SEQ?ID?No:?48所示。2.根據權利要求1所述的豬病毒基因芯片,其特征在于:所述的基質載體為經過醛基化處理的玻片。3.一種豬病毒基因芯片檢測豬病毒的方法,其特征在于:所述的基因芯片包括固定在基質載體上的探針,所述的探針包括以下病毒的特征片段:古典豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合病毒(PRRSV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV)、豬細小病毒(PPV);所述的探針由Hex、PC、NC、PRRSV-1、PRRSV-2、PRRSV-3、CSFV-1、CSFV-2、PCV1-1、PCV2-1、PCV2-2、PCV-1、PCV-2、PRV-2、PPV-2組成,其探針的核苷酸序列分別如序列表SEQ?ID?No:?1、SEQ?ID?No:?2、SEQ?ID?No:?3、SEQ?ID?No:?4、SEQ?ID?No:?5、SEQ?ID?No:?6、SEQ?ID?No:?10、SEQ?ID?No:?11、SEQ?ID?No:?23、SEQ?ID?No:?26、SEQ?ID?No:?27、SEQ?ID?No:?29、SEQ?ID?No:?30、SEQ?ID?No:?33、SEQ?ID?No:?48所示;該方法包括的步驟為:A、將已經感染上述病毒死亡的豬尸體內的糞便樣品進行核酸提取處理,得到待測樣品;B、將所述的待測樣品進行PCR反應處理,得到擴增產物;再將所述的擴增產物進行純化處理,得到純化的擴增產物;C、將所述的純化的擴增產物進行雜交處理,得到雜交產物;D、將所述的雜交產物進行掃描分析處理,得到檢測結果;B步驟中所述的PCR反應,為隨機引物PCR反應;所述的PCR反應的步驟為:a、?將上述待測樣品中,加1μl?濃度為40?pmol/μl的?primer?A,補水到10μl;引物的名稱和序列如下:Primer?A:GTTTCCCAGTCACGATANNNNNNNNNPrimer?B:GTTTCCCAGTCACGATA9N-TAMRA:TAMRA-NNNNNNNNNb、將a中的產物在65℃保存5min?,再室溫保存5min;c、配制酶體系,共計10?μl:10×?RT?Buffer:2.0?μl,25?mM?dNTP?mix:0.4?μl,所述dNTP?mix?的最終濃度為500?μM?each?nucleotide;ddH2O:?3.6?μl,0.1M?DTT:?2.0?μl?,Reverse?Transcriptase?:2.0?μl;d、向b中的產物加入上述c中10?μl酶體系后,42℃?加熱2h,再加入1?μl?RNase?H,37℃消化?30min;e、?將d中產物于95℃?加熱3?min,冰上驟冷5?min;f、?配制酶體系,共計10?μl:10×?Klenow?Buffer:3.0?μl,Klenow?酶:1.0?μl,H2O:6.0?μl;??g、?將e中產物與f中酶體系混合,于37℃加熱?1.5h,再65℃加熱5min以終止反應;h、?在g中的產物中補充加入Klenow?酶1?μl,于37℃加熱1.5h,再65℃加熱5min以終止反應;i、取上述部分h中的產物進行PCR反應:PCR反應體系為:h中的產物:6.0?μl,10×?PCR?buffer:10?μl,25mM?dNTP:1.0?μl,濃度為100pmol/μl?的Primer?B:1.0?μl,hot?start?Taq:?1.0?μl,ddH2O:?81?μl;???PCR反應程序為:?94℃預變性30s;40℃變性30?s,50℃退火30?s,72℃?延伸1?min,共40個循環;72℃?延伸7?min;4℃保存;j、取10μl上述i中的PCR產物,1%?gel電泳,看是否能出現500bp-1kb的smear條帶;k、取上述i中的PCR產物?10?μl?進行PCR標記反應:將上述i中的PCR產物加入1?μl的濃度為1μg/μl的9N-TAMRA,于95°C加熱3分鐘,再冰浴5分鐘,再加入以下成分:10×?Klenow?Buffer:2.5?μl?,濃度為2.5mM?each?的dNTP:2.5?μl,Klenow?酶:1.0?μl,ddH2O:?8?μl;再于37?°C加熱1.5h,于70?°C加熱5min,最后得到擴增產物。
    展開

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