本發(fā)明公開了黃瓜單拷貝基因在染色體上物理定位的方法，它是通過PCR擴(kuò)增獲得黃瓜單拷貝基因，然后對產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳回收純化，以純化產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，然后將第二次PCR產(chǎn)物標(biāo)備探針。分別取黃瓜根尖和盛花期植株上的花蕾進(jìn)行酶解，涂片法制片，挑選分散度高的片子，并進(jìn)一步進(jìn)行胃蛋白酶處理后，備用。最后將標(biāo)好的探針雜交到處理好的載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察信號。本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增后切膠回收，之后再進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增的方法，不僅可以去除基因組DNA的干擾，而且解決了切膠回收率低的問題；另外涂片法結(jié)合胃蛋白酶處理制作背景清晰且分散度高的片子可以提高信號的分辨率；通過此方法，可在染色體上直接檢測到的最短長度為2kb的單拷貝基因，為黃瓜的細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供了可靠的保證。

1.一種黃瓜單拷貝基因的染色體物理定位方法，其特征在于：
通過熒光原位雜交，能在黃瓜中期和粗線期染色體上檢測到最短長度為2.0kb的單拷
貝基因的熒光原位雜交信號；
所述的在黃瓜中期和粗線期染色體上檢測到最短長度為2kb的單拷貝基因的熒光原位
雜交信號，是通過以下方法獲得的：
1)黃瓜染色體上的單拷貝基因利用基因組DNA作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，1％的瓊脂糖
凝膠電泳后，切膠回收；
2)以切膠回收的DNA為模板，再進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，利用擴(kuò)增后的產(chǎn)物標(biāo)探針；
3)取酶解好的花藥或根尖，加入適量固定液制成懸濁液涂片，再利用涂片法制片，鏡
檢，挑選染色體分散度高的制片，進(jìn)一步利用胃蛋白酶消化去除細(xì)胞質(zhì)后，干燥備用；
所述根尖放入體積比為3∶1的甲醇∶冰醋酸固定液中固定至少24小時；所述花藥放入體
積比為3∶1的乙醇∶冰醋酸固定液中固定至少24小時；所述花藥和根尖的固定時間超過一周
后將根尖和花藥換到70％的乙醇中；
所述制片過程具體為：①取出酶解好的其中的一個花藥，放入另一新的1.5ml離心管
中，加入100ul的乙醇∶冰醋酸固定液，將花藥搗碎，吸出30ul的含粗線期染色體的液體，涂
于載玻片上，再加上100ul的乙醇∶冰醋酸固定液，在酒精燈上燒片干燥制片；②取出酶解好
的其中一個根尖，放在干凈的載玻片上用鑷子敲碎，再加上100ul的甲醇∶冰醋酸固定液，在
酒精燈上燒片干燥制片；
4)將標(biāo)好的探針雜交到黃瓜染色體上，通過熒光原位雜交檢測信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃瓜單拷貝基因的染色體物理定位方法，其特征在于，在
黃瓜中期和粗線期染色體上檢測到最短長度為2.0kb的單拷貝基因的熒光原位雜交信號，
是由于探針既沒有基因組DNA的干擾，并經(jīng)過第二次PCR擴(kuò)增之后，濃度較高，而且經(jīng)過預(yù)處
理的載玻片背景較干凈，易于探針雜交上去。