本發(fā)明公開了一種利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)實現(xiàn)秀麗線蟲體內(nèi)功能蛋白干涉的方法及其專用表達載體。該載體是含有一個或多個相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導肽的原核表達載體。該方法是將待鑒定的具有相互作用的靶蛋白各自編碼基因插入權(quán)利要求1-3任一所述專用表達載體中，將得到的原核表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并誘導表達，得到的重組大腸桿菌喂飼正常株系秀麗線蟲，根據(jù)秀麗線蟲生物及生化指標檢測結(jié)果評估相互作用蛋白發(fā)生干涉的能力和強度。本發(fā)明具有十分廣泛的應用前景，有望成為重組蛋白類藥物篩選的重要技術(shù)手段，同時也是進行蛋白質(zhì)功能研究的重要技術(shù)之一。

1.一種利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)實現(xiàn)秀麗線蟲體內(nèi)功能蛋白干涉的方法，是
將待鑒定的具有相互作用的靶蛋白各自編碼基因插入專用表達載體中，將得到的原核
表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并誘導表達，得到的重組大腸桿菌喂飼正常株系秀麗線蟲，
根據(jù)秀麗線蟲生物及生化指標檢測結(jié)果評估相互作用蛋白發(fā)生干涉的能力和強度；所
述專用表達載體是含有一個或多個相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導肽的原核表達載體，該蛋白轉(zhuǎn)
導肽為TAT、Antp、VP22、Poly(Arg)和/或Poly(Lys)，原核表達載體的出發(fā)載體為
pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-TOPO、pET101/D-TOPO或pQE30。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：包括以下步驟：
1)確定可能具有相互作用的靶蛋白并分別克隆其編碼基因；
2)將靶蛋白編碼基因分別插入所述專用表達載體中，得到含有蛋白轉(zhuǎn)導肽編碼
區(qū)和靶蛋白編碼基因相融合的原核表達載體；
3)將步驟2）構(gòu)建的原核表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌原核表達系統(tǒng)；
4)原核表達載體的誘導表達及蛋白表達水平檢測鑒定；
5)將步驟3）得到并經(jīng)步驟4）鑒定的體外表達靶蛋白的重組大腸桿菌單獨或
混合喂飼正常株系秀麗線蟲；
6)檢測秀麗線蟲生物及生化指標并評估靶蛋白之間發(fā)生干涉的能力和強度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶蛋白是兩個或多個具有相
互作用的功能蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述靶蛋白是秀麗線蟲自身蛋白，
或是其他物種中具有潛在相互作用的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟3）中大腸桿菌原核表達
系統(tǒng)的宿主菌為：BL21、DH5α、HB101、JM109或OP50。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于：所述誘導表達為采
用化學試劑誘導外源基因在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達，其中，化學試劑誘導表達
條件為：終濃度為1mM誘導劑IPTG誘導表達；誘導表達的OD₆₀₀=0.6－1.0；誘導表達
時間6－8小時；或
所述誘導表達為采用溫度誘導外源基因在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達，其中，
溫度誘導表達條件為：誘導表達的OD₆₀₀=0.4－0.6；誘導表達溫度42℃－44℃；誘導
表達時間6－8小時；
所述步驟4）中的蛋白表達水平檢測采用SDS-PAGE和/或免疫印跡法。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于：所述步驟5）中喂飼
秀麗線蟲的大腸桿菌需預先涂布到NGM平皿或LB平皿中；混合喂飼的比例為1:5、1:2、
1:1、2:1或5:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述步驟5）中喂飼秀麗線蟲的大
腸桿菌需預先涂布到NGM平皿或LB平皿中；混合喂飼的比例為1:5、1:2、1:1、2:1
或5:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟6）中秀麗線蟲的生物及
生化指標檢測，生物指標具體包括形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和細胞水平變化；生化指標具體包括
靶蛋白或其調(diào)控因子表達水平檢測；蛋白質(zhì)干涉前后秀麗線蟲的行為變化通過定量行
為學技術(shù)手段進行檢測；根據(jù)秀麗線蟲在蛋白干涉前后的表型差異分析獲得相互作用
蛋白發(fā)生干涉的能力和強度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述生物指標為產(chǎn)卵率變化、成
蟲率變化、是否出現(xiàn)體型變小或肥胖、是否在咽部出現(xiàn)空泡現(xiàn)象和是否出現(xiàn)運動行為
失調(diào)；表觀指標通過體視顯微鏡觀察判定。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述生化指標為蛋白質(zhì)、DNA和
RNA，其表達水平檢測為免疫印跡、凝膠遷移實驗和聚合酶鏈式反應。