本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的化學修飾，公開了一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反應方法，其中，EPO分子在第一種緩沖液中完成第一次PEG化反應后至少還包括以下步驟：將第一次PEG化反應的反應液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進一步加入PEG進行第二次PEG化反應，得到最終反應液。本發(fā)明應用多緩沖體系的反應方法，實現(xiàn)了EPO的可連續(xù)PEG化反應，建立了一種具有較高單取代率、較低多取代率的PEG化反應方法。

1.一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反應方法，其特征在于，EPO
分子在第一種緩沖液中完成第一次PEG化反應后至少還包括以下步驟：將第
一次PEG化反應的反應液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進一步加
入PEG進行第二次PEG化反應，得到最終反應液；所述第一種緩沖液為
pH6.5-7.5的磷酸緩沖液，所述與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液為與第
一種緩沖液pH值不重疊的pH6.0-9.0的磷酸緩沖液、PH7.4-9.0的硼砂緩沖
液、pH9.0-12的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或pH4.5-7.0的醋酸緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反應方法，
其特征在于，得到最終反應液前還包括以下步驟：將前一次PEG化反應的反
應液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進一步加入PEG進行后一次
PEG化反應。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反應方法，
其特征在于，在得到最終反應液前還包括以下步驟：將第二次PEG化反應的
反應液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進一步加入PEG進行第三次
PEG化反應。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述任一一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反
應方法，其特征在于，所述第一種緩沖液為pH7.2的磷酸緩沖液，所述與第
一種緩沖液不同的第二種緩沖液為pH7.4的磷酸緩沖液、pH7.4的硼砂緩沖
液、pH9.3的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或pH5.8的醋酸緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述任一一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反
應方法，其特征在于，所述PEG化反應方法包括將PEG與PEO混合反應至少
2小時，反應pH值為7.0-7.5，所述PEG與PEO的摩爾比為10-25:1，所述
PEG中聚乙二醇的分子量為30000-40000道爾頓。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反應方法，
其特征在于，所述PEG與PEO的摩爾比為10-25:1為全部PEG化反應步驟中
PEG與EPO的摩爾比。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反應方法，
其特征在于，所述PEG化反應方法包括將PEG與PEO混合反應為2.5小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述任一一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反
應方法，其特征在于，還包括在最終反應液中純化單取代PEG-EPO的步驟：
將最終反應液經(jīng)疏水層析純化得到單取代PEG-EPO與PEG的混合物，再從單
取代PEG-EPO與PEG的混合物中分離得到單取代PEG-EPO。