本發明屬生物技術領域，具體為一種質粒pCMV?RBE?TK1?N2?EF1α?hFIXml及其構建方法和應用。該質粒含CMV啟動子?RBE元件?TK1基因的篩選標記的人凝血因子IX表達框架。該質粒和rep表達質粒共轉染哺乳動物細胞可用于構建定點整合于AAVS1位點表達人類凝血因子IX的穩定細胞。使用該表達質粒制備穩定表達人類凝血因子IX的穩定細胞一方面正負雙重篩選可以防止細胞隨機突變導致的非整合細胞耐藥對轉基因細胞群純凈度的影響，提高表達效率；另一方面可以有效預防插入突變導致的基因突變和癌蛋白表達風險。通過常規分子生物學方法取代人類凝血因子IX表達框架可以構建表達其它基因的具有定點整合以及正負篩選的質粒。

1.一種含RBE順式元件、正負篩選元件的人凝血因子IX表達框架的質粒，記為pCMV-
RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其特征在于該質粒含有一個由CMV啟動子RBE元件TK1基因組成
的篩選標記；其序列為SEQ ID NO.5所示。
2.一種如權利要求1所述的含RBE順式元件、正負篩選元件的人凝血因子IX表達框架的
質粒的構建方法，其特征在于具體步驟為：
（1）構建pCMV-TK1重組質粒
將合成的攜帶XbaI和AflⅡ粘性末端的TK1基因DNA片段，通過DNA重組技術插入經XbaI
和AflⅡ雙酶切的pcNDA3.1(-)/myc-His A載體，獲得pCMV-TK1質粒；TK1基因DNA片段見SEQ
ID NO.1所示；
（2）擴增“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”片段
以質粒pCMV-TK1為模板，用含Nhe I-RBE的上游引物和含Sal I的下游引物擴增獲得
Nhe I-RBE-TK1-BGHpA-Sal I DNA片段；所述上游引物為SEQ ID NO.2所示，所述下游引物
為SEQ ID NO.3所示；
（3）構建pN2-EF1α-hFIXml重組質粒
合成含啟動子EF1α的人凝血因子FIX小基因的DNA片段，其5’端增加KpnI粘性酶切位
點，在3’端增加NotI粘性酶切位點；合成的攜帶KpnI和NotI粘性末端的hFIXml雙鏈DNA片
段，通過DNA重組技術插入經KpnI和NotI雙酶切的pEGFP-N2，得到重組質粒，記為pN2-EF1α-
hFIXml；
（4）構建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml質粒
“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”雙鏈DNA片段，通過DNA重組技術插入經NheⅠ和SalⅠ雙酶
切的pN2-EF1α-hFIXml重組質粒，獲得表達質粒，記為pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其序
列為SEQ ID NO.5所示。
3.如權利要求1所述的質粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml在建立hFIX基因定點整合
系統修飾細胞系中的應用，其特征在于具體步驟為：
（1）構建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS
pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml質粒用Apl I消化，補平后連接獲得pCMV-RBE-TK1-N2-
EF1α-MCS質粒，用于在MCS位點插入重組基因；
（2）建立hFIX基因定點整合系統修飾細胞系
合成的hFIX表達質粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml和pRC質粒共同轉染原代培養的
成細胞，使用阿昔洛韋和G418共同篩選，得到hFIX基因定點整合系統修飾細胞系。