本發明涉及一種雙探針實時熒光定量PCR方法，更具體涉及一種可區分HBV B型和非B型的雙探針實時定量PCR法。本發明建立了一種基于型特異性堿基設計的雙探針實時定量PCR法，適用于B、C基因型流行的亞洲和太平洋地區HBV感染者HBV核酸定量的同時進行粗略基因分型，并且避免了其他少見基因型的漏檢。該方法包括以下步驟：（1）設計保守引物，及針對B型和非B型的Taqman探針；（2）提取血清樣本中HBV DNA；（3）雙探針實時熒光定量PCR,同時對HBV DNA進行分型和定量。本發明建立的雙探針實時定量PCR法準確、靈敏、特異、重復性好，可以同時進行HBV DNA的定量檢測和基因分型，適合于臨床推廣。

1.一種HBV基因分型的雙探針實時定量PCR檢測引物，其特征在于：引物如下：上游引物FCTAGACTCGTGGTGGACTTCTC，下游引物RATGAGGCATAGCAGCAGGAT，B型探針TCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTC，非B型探針TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCA；利用所述引物進行HBV基因分型的雙探針實時定量PCR法包括以下步驟：（1）通過對已明確基因型的HBV全基因組序列進行比對，選擇保守區設計保守引物，即上游引物F和下游引物R，同時選擇型特異性堿基聚集區設計針對B型和非B型的Taqman探針，其中B型探針5′端標記Hex熒光基團，非B型探針5′端標記FAM熒光基團，兩者3′端均標記猝滅基團；（2）提取血清樣本中HBV?DNA；（3）雙探針實時熒光定量PCR：保守引物能擴增所有基因型HBV?DNA，而B型探針只能結合B基因型HBV?DNA，非B型探針能結合余下所有基因型HBV?DNA，然后在PCR反應進行時，Taqman探針被Taq酶水解而發出熒光，通過監測擴增曲線，并記錄熒光閾值,同時對HBV?DNA進行分型和定量。2.根據權利要求1所述的HBV基因分型的雙探針實時定量PCR檢測引物，其特征在于：雙探針實時熒光定量PCR的反應體系：?2×Premix?Ex?Taq?10μl，20μmol/L上游引物F?0.2μl，20μmol/L下游引物R?0.2μl，20?μmol/L?B型探針0.3μl，20?μmol/L非B型探針0.3μl，50×ROX?0.4μl，模板2μl，ddH₂O?6.6μl，總體積20μl；反應條件：95℃?30s?，95℃?5s、60℃?30s?40個循環，在60℃選擇Hex和FAM通道采集熒光信號，分別代表B基因型和非B基因型擴增，結果用ABI?StepOne?plus軟件確定各樣品的循環閾值。3.根據權利要求1所述的HBV基因分型的雙探針實時定量PCR檢測引物，其特征在于：以B基因型質粒作為B型擴增的標準品，C基因型質粒作為非B型擴增的標準品，分別繪制B基因型和非B基因型標準曲線，通過標準曲線對未知樣品定量；同時對HBV?DNA進行分型，若僅在Hex通道檢出紅色擴增曲線為B基因型，若僅在FAM通道檢出綠色擴增曲線為非B基因型；若同時在Hex和FAM通道檢出擴增曲線為混合基因型。