本發(fā)明公開了可溶性表達Not I的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明工程菌包括：甲基化酶Eag I M基因、限制性內(nèi)切酶Not I基因和大腸桿菌(E.coli)ER2566(mcrC-mrr)。本發(fā)明在分離和鑒定了Not I基因后，通過重組體的改建，獲得高效可溶性表達Not I的工程菌。本發(fā)明通過對重組工程菌進行誘導(dǎo)條件摸索及蛋白純化工藝的優(yōu)化，制備出高純度的Not I限制性內(nèi)切酶。

1.可溶性表達Not?I的工程菌，包括：含有甲基化酶Eag?IM基
因的原核表達載體pBR322、含有限制性內(nèi)切酶Not?I基因的原核表達
載體pACYC184和大腸桿菌(E.coli)ER2566(mcrC-mrr)；所述甲
基化酶Eag?IM基因的堿基為SEQ?ID?NO.1所示；所述限制性內(nèi)切酶
Not?I基因的堿基為SEQ?ID?NO.3所示。
2.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述工程菌的方法，包括：(1)將甲基
化酶Eag?IM基因與原核表達載體pBR322可操作性的相連接，得到重
組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)ER2566(mcrC-mrr)，
構(gòu)建得到中間菌；(2)將限制性內(nèi)切酶Not?I基因與原核表達載體
pACYC184可操作性的相連接，得到重組質(zhì)粒；(3)將步驟(2)所
得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟(1)所得到的中間菌，篩選，鑒定，即得；
所述甲基化酶Eag?IM基因的堿基為SEQ?ID?NO.1所示；所述限
制性內(nèi)切酶Not?I基因的堿基為SEQ?ID?NO.3所示。
3.權(quán)利要求1所述的工程菌在制備Not?I酶中的應(yīng)用。
4.按照權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，包括：培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的
工程菌，誘導(dǎo)蛋白表達；收集、純化所表達的蛋白，即得。
5.按照權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的誘導(dǎo)條件
是：溫度為20℃，IPTG終濃度為0.35mmol/L，轉(zhuǎn)速為55r/min，誘
導(dǎo)時間10小時。
6.按照權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的蛋白純化
方法采用purifier?100蛋白純化系統(tǒng)進行純化，包括：DEAE
Sephrose?FF離子交換層析、Phenyl?HP疏水層析和Superdex?75
10/300GL分子篩層析三步純化。
7.按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的離子交換
層析，所采用的結(jié)合緩沖液包括：20mmol/L?Tris-HCl，pH7.5；所采
用洗脫緩沖液包括：20mmol/L?Tris-HCl，1mol/L?NaCl，pH7.5；
所述的疏水層析，所采用的結(jié)合緩沖液包括：50mmol/L?Na₃PO₄，
1.5mol/L(NH₄)₂SO₄，pH7.5；洗脫緩沖液包括：50mmol/L?Na₃PO₄，pH7.5；
所述的分子篩層析，所采用的平衡緩沖液包括：10mmol/L
Tris-HCl，100mmol/L?NaCl，10mmol/L?MgCl₂，pH7.5。