本發明提供了一種非洲豬瘟P30蛋白重組桿狀病毒表達載體及其制備方法，其是從含ASFVP30全長基因的質粒PCR?4TOPO?P30中擴增出P30基因，將擴增的P30基因連接至桿狀病毒載體pFastBac 1中，構建重組桿狀病毒載體pFastBac1?ASFV?P30，轉化至大腸桿菌感受態細胞DH10Bac中，獲得重組穿梭桿粒rBacmid?ASFV?P30，鑒定正確后將其轉染至Sf 9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒，并將重組桿狀病毒進行傳代擴增，將高滴度的含有ASFV P30基因的桿狀病毒接到High Five昆蟲細胞中進行ASFV P30蛋白的真核表達。選用本發明方法構建非洲豬瘟P30蛋白重組桿狀病毒表達載體，并利用重組桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中表達非洲豬瘟P30蛋白，為非洲豬瘟血清學ELISA檢測方法的建立奠定了基礎。

1.一種非洲豬瘟P30蛋白重組桿狀病毒表達載體的制備方法，所述重組桿狀病毒表達載體為pFastBac1-ASFV-P30，其核苷酸序列包含SEQ ID NO：2，其中所述非洲豬瘟P30蛋白重組桿狀病毒表達載體是在重組修飾的昆蟲桿狀病毒表面展示有非洲豬瘟P30蛋白，所述非洲豬瘟P30蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO：2中第31-612位核苷酸；所述重組桿狀病毒表達載體的制備步驟包括：(1)構建重組桿狀病毒載體pFastBac1-ASFV-P30和重組穿梭桿粒rBacmid-ASFV-P30；和(2)在昆蟲細胞中表達非洲豬瘟P30蛋白；所述步驟(1)為：a、根據ASFV基因組序列，GenBank登陸號：FN557520.1中的CP204L基因設計特異性引物對；b、采用PCR技術，從含有非洲豬瘟病毒P30全長基因序列的克隆質粒PCR-4TOPO-P30中擴增出ASFV P30基因序列，將擴增的PCR產物進行膠回收得到包含序列為SEQ ID NO：2的基因片段1，將桿狀病毒載體pFastBac1經BamH1/Xho I雙酶切后進行膠回收得到載體基因片段2，將基因片段1插入到載體基因片段2中，轉化至E.coli DH5α感受態細胞，37℃培養，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養基中培養，提取質粒，進行BamH1/Xho I雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，測序鑒定正確，獲得重組桿狀病毒載體pFastBac1-ASFV-P30；c、將重組桿狀病毒載體pFastBac1-ASFV-P30轉化至含有穿梭載體Bacmid的E.coliDH10Bac中，構建重組穿梭桿粒rBacmid-ASFV-P30；所述步驟(2)為：a、將狀態較好的Sf9細胞鋪于六孔板中，細胞密度約為2×10⁶/ml，將重組穿梭桿粒rBacmid-ASFV-P30轉染至Sf9昆蟲細胞，27℃培養，3～5d后離心收集上清，標記為P1代重組桿狀病毒，同時設未轉染的空細胞對照，將P1代重組桿狀病毒液按1％的體積分數進行傳代，得到P2、P3代重組桿狀病毒；b、將上述P3代重組桿狀病毒上清以2％體積分數接種至High Five昆蟲細胞單層，同時設置未接毒的空白對照，27℃培養3～4d，將細胞裂解后離心收集ASFV P30重組蛋白；c、將細胞裂解后離心收集的ASFV P30重組蛋白進行間接免疫熒光試驗和WesternBlotting分析。2.根據權利要求1所述的非洲豬瘟P30蛋白重組桿狀病毒表達載體的制備方法，其特征在于：所述特異性引物對序列為：ASFV-P30-Fwd:5’-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATATGGATTTTATTTTAAATATATC-3’SEQ ID NO：3，ASFV-P30-Rev:5’-CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTTTTTTAAAAGTTTAAT G-3’SEQ ID NO：4；述特異性引物對中，在上游引物ASFV-P30-Fwd的5’端引入BamH1限制性內切酶位點和6個組氨酸His序列，在下游引物ASFV-P30-Rev的5’端引入Xho I限制性內切酶位點和6個組氨酸His序列。3.根據權利要求2所述的非洲豬瘟P30蛋白重組桿狀病毒表達載體的制備方法，其特征在于：所述PCR反應體系為25μL：上、下游引物各0.5μL，dNTP2μL，模板1μL，rTaq酶0.5μL，10×PCR Buffer2.5μL，滅菌去離子水補足至25μL；反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性45s，53℃退火45s，72℃45s，30個循環，72℃延伸10min；PCR產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳。