本發明公開一株羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制備方法與應用。本發明以羊布魯氏菌M5基因組為模板，PCR得到znuA基因的上、下游同源臂，并將其連接，得到片段ΔznuA；將片段ΔznuA克隆至載體pRE112上，得到重組質粒pRE-ΔznuA；將該質粒導入羊布魯氏菌M5-Δbp26細胞中，分別通過氯霉素和蔗糖選擇培養基篩選，得到同源重組雙交換子，為重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA。該菌株較M5親本菌株，生長特性一致，遺傳穩定使其不易返祖，毒力小且免疫效果保持良好，并因bp26基因缺失標記可應用于區分檢測自然感染或人工免疫。因此，該菌株可作為一種效果更佳的標記疫苗應用于臨床。

1.一株羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制備方法，其特征在于
包括以下步驟：
(1)自殺性同源重組質粒的構建
①以羊布魯氏菌(Brucellamelitensis)M5基因組DNA為模板進行PCR，
使用的引物為P1和P2時，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物為P3
和P4時，得到znuA基因的下游同源臂；
P1：5′-GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC-3′；
P2：5′-TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3′；
P3：5′-GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3′；
P4：5′-AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3′；
②利用OverlapPCR的方法，以步驟①中制備的znuA基因的上游同源臂
和znuA基因的下游同源臂為模板，P1和P4為引物對，得到用于同源重組的
目的片段ΔznuA；
③用KpnI和SacI分別對自殺性質粒載體pRE112和用于同源重組的目的
片段ΔznuA進行雙酶切，純化；將純化回收的片段ΔznuA和載體片段pRE112
連接，得到自殺性同源重組質粒pRE-ΔznuA；
(2)羊布魯氏菌重組菌株的構建及篩選
①將自殺性同源重組質粒pRE-ΔznuA導入羊布魯氏菌M5-Δbp26的感受
態細胞中；接著涂布于含有氯霉素的TSA-YE平板上，在氯霉素的選擇壓力下，
得到同源重組單交換子；將PCR鑒定正確的同源重組單交換子在TSB-YE中
培養，松弛質粒抗性；
②接著將松弛質粒抗性后的同源重組單交換子涂布于TSA-YE-Sucrose選
擇培養基上培養，利用自殺性同源重組質粒pRE-ΔznuA中sacB基因對蔗糖
的敏感性，對自殺質粒進行消除，利用引物P1和P4對TSA-YE-Sucrose選擇
培養基上生長的菌落進行PCR篩選，獲得同源重組雙交換子，即得到羊布魯
氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA；
所述的TSA-YE-Sucrose選擇培養基的組成如下：胰蛋白胨大豆酵母浸膏
瓊脂培養基+終濃度為質量體積比7％的蔗糖。
2.根據權利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制備
方法，其特征在于：步驟(1)①中所述的PCR的條件為94℃2min；98℃10
s、56℃30s、68℃1.5min，30個循環；68℃5～10min終延伸。
3.根據權利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制備
方法，其特征在于：步驟(1)②中所述的OverlapPCR的條件為94℃2min
預變性；98℃10s、56℃30s、68℃3min，30個循環；68℃5～10min終
延伸。
4.根據權利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制備
方法，其特征在于：步驟(2)①中所述的導入的方式為通過電轉化方式導入。
5.根據權利要求4所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制備
方法，其特征在于：所述的電轉化的條件為1mm電極杯，1.8kv，400Ω。
6.根據權利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制備
方法，其特征在于：步驟(2)①中所述的氯霉素在所述的TSA-YE培養基中
的終濃度為5μg/mL。
7.根據權利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制備
方法，其特征在于：步驟(2)①中所述的培養的條件為37℃、200r/min搖
床上培養36～48h；
步驟(2)②中所述的培養的條件為37℃培養48～96h。
8.根據權利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制備
方法，其特征在于：步驟(2)①中所述的PCR鑒定為通過引物P1和P4進
行鑒定；
所述的PCR鑒定的條件如下：94℃2min預變性；98℃10s、56℃30s、
68℃3min，30個循環；68℃5～10min。
9.一株羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA，其特征在于：通過權利
要求1～8任一項所述的制備方法得到。
10.權利要求9所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA在制備用
于預防和/或治療布魯氏菌病的疫苗中的應用。