本發明公開了構建無選擇標記的自主發光膿腫分枝桿菌的方法及建立相應體外高通量篩藥模型。在該構建過程中，關鍵是重組質粒pOPAI1B的構建，pOPAI1B中含有發光所需酶基因，抗性篩選基因和整合酶基因的融合基因，位于融合基因兩端的同向重復序列和，以及噬菌體整合位點和復制子。重組質粒pOPAI1B轉入膿腫分枝桿菌中經過篩選獲得抗性基因和整合酶基因均丟失的無抗性篩選標記的自主發光膿腫分枝桿菌。本發明構建的自主發光膿腫分枝桿菌可以高通量篩選藥物，通過檢測細菌發光情況判定藥物的殺菌或抑菌效果，可用于體外藥物活性檢測，不需要任何底物，可連續檢測同一樣品，靈敏度高，重復性強。

1.一種轉化膿腫分枝桿菌的重組質粒pOPAI1B，其特征在于：該重組質粒pOPAI1B按逆
時針方向依次含有啟動子，發光所需酶基因LuxCDABE，抗性篩選基因Apr和整合酶基因Int
的融合基因，位于融合基因兩端的同向重復序列DifR和DifL，以及噬菌體整合位點attP和
復制子；
所述噬菌體整合酶Int為分枝桿菌噬菌體Tweety的整合酶Int，其序列如SEQ ID NO:6
所示；
所述的噬菌體整合位點attP為分枝桿菌噬菌體Tweety的attP位點，其序列如SEQ ID
NO:4所示；
所述的抗性篩選基因為安普霉素抗性基因Apr，其序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據權利要求1所述的一種轉化膿腫分枝桿菌的重組質粒pOPAI1B，其特征在于：所
述DifR的序列如SEQ ID NO:2所示，DifL的序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根據權利要求1所述的一種轉化膿腫分枝桿菌的重組質粒pOPAI1B，其特征在于：該
重組質粒pOPAI1B的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.一種無抗性篩選標記的自主發光的膿腫分枝桿菌的制備方法，其特征在于：其制備
方法包括以下步驟：
1)電轉化法將權利要求1～3任一項所述的重組質粒pOPAI1B轉入膿腫分枝桿菌中，獲
得自主發光膿腫分枝桿菌；
2)將獲得的自主發光膿腫分枝桿菌傳代培養篩選出抗性基因和整合酶基因均丟失的
發光菌即為無抗性篩選標記的自主發光膿腫分枝桿菌。
5.根據權利要求4所述的一種無抗性篩選標記的自主發光的膿腫分枝桿菌的制備方
法，其特征在于：步驟2)的具體操作為：將步驟1)得到的發光菌挑取少量菌落到無抗性的
7H9培育基中，搖床培養，培養物稀釋后鋪板37℃培養，挑取多個單菌落同時劃線到無抗生
素的7H11板和含安普霉素(Apr)的7H11板上，37℃培養，挑取在Apr板上未長出，而在相應的
無抗板上長出的克隆到7H9培養基中培養，再取培養物鋪于Apr板上培養，若平板上無單克
隆長出，則篩選所得相應克隆是正確的丟失Apr抗性的克隆。