本發(fā)明公開了一種千層塔發(fā)狀根系的制備與培養(yǎng)方法，屬生物細(xì)胞工程技術(shù)。該方法取千層塔幼嫩莖為外植體進(jìn)行脫分化處理，獲得新鮮千層塔愈傷組織，將愈傷組織與含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌(DL1968)共培養(yǎng)，以無菌紙吸取多余菌液后轉(zhuǎn)入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，在千層塔愈傷組織處生長(zhǎng)出千層塔發(fā)狀根；抑菌培養(yǎng)后將具有發(fā)狀根的外植體放入擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。本發(fā)明利用生物細(xì)胞工程技術(shù)建立千層塔發(fā)狀根系培養(yǎng)系統(tǒng)，制備千層塔發(fā)狀根系，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)千層塔，替代野生資源，緩解了千層塔日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，而且解決了千層塔依賴進(jìn)口問題。對(duì)藥用植物發(fā)狀根的工業(yè)化和商業(yè)化開發(fā)具有重要意義。

1.一種千層塔發(fā)狀根系的制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，
該方法通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：
(1)將千層塔幼嫩莖剪成1～5cm的小段，無菌操作臺(tái)中用HgCl₂處理6～13min，酒精
浸泡5～10s，無菌水沖洗3～8遍后轉(zhuǎn)入到B₅+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培養(yǎng)基中，26℃±1
下
暗培養(yǎng)12-20d，獲得千層塔愈傷組織；
(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060菌株用1μL無菌水稀釋后，涂布在20mL?YEB固體培養(yǎng)基
上，25℃±1下培養(yǎng)2～4d，長(zhǎng)出克隆菌體;
(3)挑取由步驟(2)獲得的克隆菌體的單菌落接種于50mL液體YEB培養(yǎng)基中，25℃±3
振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時(shí)，OD值為0.3～1.2，取1ml菌液置于100mlYEB液體培養(yǎng)
基中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)8h，OD值為0.3～0.9，收集菌液，3500rpm下離心5～15分鐘收集菌
體；
(4)將步驟(3)收集的菌體置于100ml含有100μmol/L乙酰丁香酮的B₅液體培養(yǎng)基中并混
勻；
(5)用步驟(4)混勻后得到的菌液浸染千層塔愈傷組織10～30min，取出后用無菌紙
吸取多余的菌液，將浸染的千層塔愈傷組織接入到含有100μmol/L乙酰丁香酮、0.7％瓊脂
的B₅固體培養(yǎng)基中1-2d；
(6)把含有400mg/L頭孢噻肟鈉的無激素B5固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將步驟(5)
浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；25℃±1黑暗培養(yǎng)，每3～9d
繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈；
(7)用無激素B5液體培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后1g的誘導(dǎo)出來的發(fā)狀根放
入50mL的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，25℃±1黑暗懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為100～110r·min^-1。