本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及單核苷酸多態(tài)性的分析檢測，具體涉及一種普適的利用缺口-連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目標(biāo)DNA，將DNAzyme序列引入連接產(chǎn)物中，然后利用Lambda外切酶降解沒有參與連接反應(yīng)的磷酸化探針，及外切酶III釋放DNAzyme的檢測方法。本發(fā)明將DNAzyme探針與Gap-LCR探針相結(jié)合，通過在LCR體系中的待連接的一個磷酸化探針中加入一段DNAzyme序列，Gap-LCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束以后，向體系中加入Anti-G序列（與探針中的DNAzyme序列部分互補(bǔ)配對），利用Lambda外切酶降解5端磷酸化的DNA探針，然后利用外切酶III釋放連接產(chǎn)物中的DNAzyme，通過DNAzyme的特性來進(jìn)行SNP的定性和定量檢測。本發(fā)明具有簡單、方便、實用、經(jīng)濟(jì)，廣泛適用于各種單核苷酸多態(tài)性檢測。

1.一種檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是：在連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Ligase?Chain?Reaction或
者缺口-連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Gap-LCR體系中加入兩組探針，其中一個5’-端磷酸化探針的3’-
端用DNAzyme標(biāo)記，在進(jìn)行目標(biāo)核酸的鏈?zhǔn)竭B接酶擴(kuò)增反應(yīng)過程中，依次在DNA聚合
酶和DNA連接酶的作用下將DNAzyme引入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，LCR擴(kuò)增以后，向擴(kuò)增的產(chǎn)
物中引入能與DNAzyme的序列部分互補(bǔ)的阻斷序列Anti-G，同時加入終濃度為100mM
的NaCl以促進(jìn)Anti-G和DNAzyme更好的形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后利用Lambda外切酶選擇
性切割雙鏈DNA中的5’-端磷酸化的DNA探針，而對連接產(chǎn)物不起作用，此時體系中主
要存在著沒有磷酸化的探針和連接產(chǎn)物，接著利用外切酶III降解雙鏈DNA的3’-端為平
末端或者凹陷末端的序列，從DNA鏈的3’-端釋放單磷酸核苷酸，產(chǎn)生單鏈DNA片段，
將連接產(chǎn)物中的DNAzyme標(biāo)記釋放，通過檢測LCR消化產(chǎn)物中釋放出的DNAzyme標(biāo)記
物來進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的定性或定量分析；寡核苷酸探針中含有一段15個堿基以上的
序列能與目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)，阻斷序列Anti-G與DNAzyme序列有12個堿基的序列完全
互補(bǔ)配對，使DNAzyme序列處于封閉狀態(tài)，以保證Lambda外切酶能夠徹底消化LCR擴(kuò)
增反應(yīng)以后體系中剩余的含DNAzyme序列的磷酸化探針，從而降低檢測背景；本方法不
以疾病診斷和治療為目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征是：所述寡核苷酸探針中的
DNAzyme標(biāo)記是一種能夠產(chǎn)生信號的、具有過氧化物酶催化功能的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征是：所述核酸聚合酶是一種不
具有5’-3’和3’-5’外切酶活性的耐熱性核酸聚合酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征是：所述核酸連接酶是一種具
有耐熱性的核酸連接酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征是：所述的Lambda外切酶是
一種5’-3’外切脫氧核糖核酸酶，能選擇性切割雙鏈DNA中的5’-端磷酸化的DNA序列，
對單鏈DNA和未磷酸化DNA的活性較低、對含有切口的DNA無活性、對缺口的DNA
活性有限。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征是：所述的外切酶III是一種
具有3’-5’的脫氧核糖核酸酶活性的外切酶，降解雙鏈DNA的平末端，5’-突出末端或切口，
從DNA鏈的3’-端釋放5’-單磷酸核苷酸，產(chǎn)生單鏈DNA片段；該酶對具有至少有4個堿
基且末端不是C殘基的3’-突出末端的DNA、單鏈DNA、硫代磷酸酯連接的核苷酸無活
性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征是：所述寡核苷酸探針有20-25
個核苷酸與目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)配對，DNAzyme序列不包含在此片段中。